En busca de la mejor opción terapéutica para disminuir la necrosis en colgajo cutáneo random en ratas : (técnica de retardo de colgajo versus células madres derivadas de tejido adiposo precondicionadas con hipoxia.)

Abstract

La isquemia y necrosis constituyen uno de los mayores problemas en cirugía reconstructiva, en particular en los colgajos cuyo aporte vascular es deficiente. Se ha investigado distintos métodos adicionales a la acción quirúrgica con el propósito de aumentar la vitalidad del colgajo. Entre estos se encuentran la administración de células madre mesenquimales de tejido adiposo (ASCs), de médula ósea (BM- MSCs), células madre mesenquimales precondicionadas, retardo del colgajo (RTC), tratamiento farmacológico, terapia genética, entre otros. El objetivo de este estudio, es evaluar la mejor opción terapéutica para disminuir la necrosis en un colgajo cutáneo random en ratas que está predispuesto a necrosis en su porción distal. Para ello se utilizaron 40 ratas macho adultas sometidas a colgajo cutáneo random en el área dorsal de 1:4 (2x8cm) fueron randomizadas en cuatro grupos de 10 animales: grupo 1 control, grupo 2 de retardo del colgajo de 5 días, grupo 3 intervenido con ASCs en condiciones de normoxia (21% O2 y 5% CO2) y grupo 4 intervenido con ASCs precondicionadas con hipoxia (ASCs-H) durante 72 horas previa a su administración (2% O2 y 5% CO2). Los cultivos de células madre fueron analizados mediante microscopio invertido e inmunofluorescencia con los anticuerpos vimentina y CD90(Thy-1) y se realizaron estudios comparativos de proliferación y de migración celular entre las ASCs y ASCs-H. Al séptimo día post operatorio se realizó eutanasia y se fijaron las muestras en Duboscq Brasil para ser procesadas con técnicas histológicas de hematoxilina- eosina, histoquímicas (Tricrómico y Picro-Sirius) e inmunohistoquímica VEGF. La cuantificación de colágeno tipo I y III, visualizadas con técnica de Picro-Sirius con luz polarizada, se realizó con el software Image-Pro® Plus Version 6.0. Por último se realizó cálculo del área de necrosis y se confeccionó una clasificación de necrosis del colgajo cutáneo del cual deriva un score según los hallazgos macroscópicos e histopatológicos. Se consideró significancia estadística p ≤ 0,05. En el grupo control se obtuvo un porcentaje de necrosis en promedio de 45,63% +/- 18,27, en el grupo RTC 32,72% +/- 24,75, ASCs 28,73% +/- 16,31 (p = 0,04) y ASCs-H 27,99% +/- 10,08 (P=0,01). Se obtuvo un score de necrosis en el grupo control de 96,5 +/ 56,93, grupo retardo de colgajo 47,39 +/- 43,88 (p<0,05), grupo ASCs 57,92 +/- 34,66 y grupo ASCs-H con un score total de 58,34 +/- 23,86. En conclusión, la exposición a hipoxia de las células madres aumenta la proliferación y migración celular en forma significativa. La administración subcutánea de ASCs y en mayor medida las ASCs-H disminuye significativamente el área de necrosis respecto al grupo control. En el grupo de retardo de colgajo a pesar de no mostrar diferencias en la disminución del área de necrosis, el grado de necrosis es menor al séptimo día (según clasificación), observándose en algunos casos mayor capacidad de reepitelización respecto al resto de los grupos. La clasificación de necrosis de colgajo cutáneo random podría ser utilizada por otros autores para estudios futuros. Finalmente no se acepta la hipótesis de este estudio. El tratamiento con ASCs y en mayor medida las ASCs-H, logran disminuir significativamente el área de necrosis respecto al control, pero sin diferencia estadística entre ellas, sin embargo al considerar el tipo de necrosis según la clasificación, el grupo de RTC presenta un menor score y por lo tanto necrosis de menor grado respecto al resto de los grupos tratados.

Ischemia and necrosis are one of the biggest problems in reconstructive surgery, especially in the flaps when the blood supply is deficient. Various methods have been investigated in order to increase the vitality of the flap. These include the administration of mesenchymal stem cells from adipose tissue (ASCs), bone marrow (BM-MSCs), preconditioned mesenchymal stem cells, delay flap (RTC), drug therapy, gene therapy, among others. The objective of this study is to evaluate the best therapeutic option to reduce necrosis in a random skin flap in rats predisposed to necrosis in distal portion. 40 adult male rats’ random skin flaps in the dorsal area of 1: 4 (2x8cm) were used and will be randomized into four groups of 10 animals: group 1 control group, 2 flap delay of 5 days, Group 3 administration of ASCs in normoxia (21% O 2 and 5% CO2) and Group 4 ASCs management preconditioned with hypoxia (ASCs-H) for 72 hours prior to administration (2% O2 and 5% CO2). Stem cell cultures were analyzed with an inverted microscope and immunofluorescence with antibodies anti-vimentin and anti-CD90 (Thy-1), and comparative studies of proliferation and cell migration were performed between ASCs and ASCs-H. On the seventh postoperative day the rats are euthanized and samples fixed in Duboscq Brazil were processed by histological techniques hematoxylin-eosin, histochemical (Masson and Picro-Sirius) and immunohistochemistry VEGF. Finally necrosis area calculation was performed and a classification of skin flap necrosis which derived a score according to macroscopic and histopathological findings were constructed. Statistical significance p ≤ 0,05 was considered. In the control group a percentage of necrosis was obtained on average 45.63% + - 18.27, in the RTC group 24.75% +/- 32.72, ASCs 28.73% +/- 16.31 (p = 0,04) and ASCs-H 27.99% +/- 10.08 (P = 0,01) . A score of necrosis in the control group 96.5 +/- 56.93, group delay flap 47.39 +/- 43.88 (p <0,05), ASCs group 57.92 +/- 34, 66 and ASCs-H group with a total score of 58.34 +/- 23.86. In conclusion, exposure to hypoxia significantly increased stem cell proliferation and cell migration. Subcutaneous administration of ASCs and further the ASCs-H significantly reduced the area of necrosis compared to the control group. While the group delay flap despite not show differences in decrease of the area of necrosis, the degree of necrosis is lower on the seventh day (according to the classification), observed in some cases greater reepithelialization capacity compared to the other groups. The classification of random skin flap necrosis could be used by other authors for future studies. The hypothesis of this study is rejected. Treatment with ASCs and further the ASCs-H, reduce significantly the area of necrosis compared to the control, but no statistical difference between them, however when considering the type of necrosis by classification, the RTC group has a lower score and therefore lesser extent necrosis compared to other treatment groups.