Determinación de levaduras Brettanomyces spp en vinos chilenos a través de pruebas moleculalres.

Abstract

Brettanomyces es considerado un agente de deterioro importante, encontrado en diferentes vinos de distintas zonas geográficas del mundo. Los objetivos del presente trabajo consistieron en determinar la presencia de levaduras Brettanomyces en vinos chilenos con carácter “Brett”, a través de métodos moleculares como PCR y RFLP, además de establecer una relación entre las características químicas de los vinos y la presencia de dicha levadura. Para esto, se analizaron veintidós muestras de vinos provenientes de dieciséis viñas diferentes, las cuales evidenciaban un notable deterioro debido a la presencia de aromas generalmente atribuidos por los enólogos a la actividad de levaduras del género Brettanomyces spp.. Las muestras de vino fueron sembradas en placas con medio selectivo para Brettanomyces spp., con el subsiguiente desarrollo de colonias en dieciséis de las veintidós muestras. De estas colonias se extrajo ADN para realizar una caracterización molecular de las levaduras obtenidas, la que consistió en la amplificación por PCR de la región 5.8S-ITS del rRNA y la subsiguiente digestión de los amplificados utilizando dos enzimas de restricción HaeIII y HinfI. La correspondiente identificación de los perfiles obtenidos se realizó utilizando cepas conocidas de Brettanomyces spp. y la clasificación de especies de Esteve-Zarzoso et al., (1999). A través de la aplicación de estos métodos moleculares, fue posible la identificación del género Brettanomyces spp. en el 45,5% de las muestras analizadas. Identificándose la presencia de Brettanomyces bruxellensis. En esta especie se observó un tipo de polimorfismo presente en el 50% de las muestras, fenómeno que puede ser atribuído a mutaciones. Además fue posible identificar levaduras del género Candida spp., no siendo posible la determinación de la especie. Por otro lado, se llevaron a cabo los análisis químicos básicos para cada muestra evaluada resultados que fueron utilizados para llevar a cabo un análisis multivariante de tipo discriminante, con el cual fue posible la agrupación de las muestras de vino en relación a las especies del género Brettanomyces spp. encontradas. Por los resultados obtenidos se puede concluir que existe evidencia de levaduras Brettanomyces spp. en vinos chilenos con carácter “Brett”, confirmándose que la técnica de PCR es una herramienta rápida para su correcta identificación, permitiendo distinguir entre levaduras de diferente géneros o de diferentes especies del género Brettanomyces spp.

DETERMINATION OF Brettanomyces spp IN CHILEAN WINES USING MOLECULAR METHODS. The aims of this work were to determine the presence of yeasts Brettanomyces in Chilean wines with character "Brett", by using PCR and RFLP analysis, and to establish a relation between the chemical characteristics of the wines and the presence of this yeast. Twenty two samples were examined including wines from 16 different wineries, which were presenting aromas typical of the activity Brettanomyces. Samples were plated in selective medium and 16 rendered colonies. For the molecular characterization of yeasts restriction patterns using HaeIII and HinfI were generated from the region spanning the internal transcribed spacers (ITS1 and ITS4) and the 5.8S rRNA gene. The identification was realized according to the classification of species of Esteve-Zarzoso et al., (1999). Forty five percent of the samples were identified as Brettanomyces bruxellensis and twenty seven percent were identified as Candida spp. Discriminant analysis applied to chemical basic analysis for every sample, grouped the samples of wine in relation to the species that were found. We conclude that the use of this molecular approach is very useful as a new rapid and easy method of routine yeast identification. It provide evidence for the occurrence of Brettanomyces spp. in Chilean wines with character "Brett".