Inhibición de la Expresión del Gen de la Deshidrogenasa Aldehídica: Evaluación del Sistema de RNA de Interferencia

Abstract

El alcoholismo es una enfermedad multifactorial que genera una serie de trastornos personales, sociales y de salud pública. Según estimaciones del Ministerio de Salud de Chile el abuso en el consumo de alcohol y el alcoholismo causa pérdidas al país por US$3.000 millones anuales.

Luego de la oxidación hepática del etanol, el acetaldehído generado es metabolizado a acetato por la deshidrogenasa aldehídica 2 (ALDH2*1). En la población Asiática existen individuos que poseen una variante de la ALDH2 con baja actividad (ALDH2*2) los que experimentan un marcado aumento del acetaldehído sanguíneo después de una ingesta alcohólica. Este incremento del acetaldehído causa diversos efectos tales como el enrojecimiento facial, palpitaciones, hipotensión, cefaleas y náuseas (conocido como “fenotipo asiático”) los que producen un rechazo al consumo del alcohol. Los heterocigotos (ALDH2*1/ALDH2*2) beben moderadamente, mientras que los homocigotos (ALDH2*2/ALDH2*2) son abstemios.

El tratamiento farmacológico del alcoholismo se basa en el uso de diversos medicamentos como la naltrexona y el acamprosato que actúan en el sistema nervioso central bloqueando los receptores de endorfinas y NMDA, inhibiendo la sensación de placer asociada al alcohol o disminuyendo los síntomas de la abstinencia alcohólica. Otro fármaco utilizado es el disulfiram, un modificador químico de grupos sulfhidrilos, que inhibe la ALDH2 produciendo un aumento en el nivel de acetaldehído cuando el paciente bebe alcohol, emulando el fenotipo asiático. Estos fármacos requieren administración diaria lo que a causa de la baja adhesión a los tratamientos farmacológicos, reduce su eficacia terapéutica. Un nuevo fármaco de efecto prolongado, que emule el fenotipo asiático sin los efectos secundarios del disulfiram, sería de gran ayuda en el campo del alcoholismo.

En esta tesis se evaluó la utilidad de dos algoritmos para diseñar racionalmente siRNAs eficientes que disminuyan la actividad de la ALDH2, mediante la degradación selectiva de su mensajero. El objetivo final fue generar un siRNA como herramienta genética en el campo del alcoholismo o como posible fármaco para su tratamiento.

Se diseñaron y estudiaron tres RNAs interferentes dirigidos a distintos sitios del RNA mensajero de la ALDH2 de rata. Dos de ellos disminuyen en 60-70% la actividad de la ALDH2 en células humanas HEK-293 que expresan el gen de la enzima de rata. Empleando la secuencia del RNA interferente más prometedor (siRNA2) se diseñaron y probaron tres genes que, estando bajo el control del promotor del RNA U6 humano, dan origen a horquillas de RNA (shRNA a, b y c) precursoras del siRNA2. El shRNAc, codificado en un plásmido, disminuyó en 50% la actividad de la ALDH2 en células HEK-293. La reducción de actividad concuerda con el 60% de disminución de su mensajero. Esta disminución es específica, puesto que el mensajero de la β-actina y el de IFITM-1 se mantuvieron constantes. La transducción de células de hepatoma de rata H4-II-E-C3 con un vector adenoviral de 1ra generación que codifica la misma horquilla (AdV-shRNAc) disminuyó en 10-15% la actividad de la ALDH2 endógena. La pérdida de eficiencia probablemente se debe a la inhibición de exportina 5 y Dicer, por acción del RNA VAI codificado en los adenovirus.

Finalmente, los algoritmos permitieron diseñar siRNAs que reducen la actividad de la ALDH2 por sobre el 50%. La transfección de células humanas (HEK-293) con dos de los tres siRNAs sintetizados químicamente o con un plásmido que codifica un shRNA, redujeron significativamente la actividad de la ALDH2 en células humanas, estableciendo que la interferencia por RNA es una estrategia de silenciamiento génico de utilidad para disminuir la actividad de la ALDH2.