Células T γδ intraepiteliales intestinales y su influencia en la homeostasis intestinal: Estudio de la producción de CCL4 y flujos de calcio intracelular a través de la activación del complejo TCR γδ

Abstract

Las células T intraepiteliales intestinales (iIELs) están localizadas entre los enterocitos del epitelio intestinal y poseen un estado de activación intrínsecamente alto caracterizado por la expresión de CD69 y otros marcadores de activación. La activación del complejo TCR de las iIELs γδ induce la actividad citolítica, la producción de IFN-γ y una disminución de la expresión del complejo TCR de superficie; sin embargo, se desconoce el papel que juega el Ca2+ intracelular en su señalización y función. Por otra parte, la capacidad de homing de células T reguladoras (Tregs) a la lámina propia es importante en la mantención de la tolerancia inmune intestinal. Por lo tanto, el papel del TCRγδ fue estudiado en cuanto a la movilización de Ca2+ intracelular en iIELs y su relación con la expresión de la quimioquina CCL4. Esta quimioquina ha sido asociada a la inducción de homing de Tregs CCR5+ a diferentes tejidos. De esta forma, nosotros describimos que las iIELs γδ y αβ producen CCL4 e IFN-γ de forma dependiente de CD3/TCR así como también dependiente de Ca2+/PKCs. CCL4 es producida fundamentalmente en las iIELs γδ de manera transitoria en comparación con las células T γδ de bazo. El aumento del Ca2+ intracelular per se como la estimulación del complejo TCR contribuyen a la activación celular dado por el aumento de la producción de CCL4 e IFN-γ en las subpoblaciones iIELs γδ y αβ ex vivo, respectivamente. Encontramos que el estado basal de activación intracelular de las iIELs, obtenidas de ratones reporteros γδ (H2B-EGFP) según las [Ca2+]i, es intrínsecamente elevado. Sin embargo, la amplitud de las [Ca2+]i fue menor respecto a la de células T sistémicas, en respuesta a la estimulación del TCR ex vivo con los mAbs anti-CD3 o anti-TCRγδ (clon GL3). La activación del complejo TCRγδ de ratones reportero γδ in vivo, que disminuye la expresión del complejo TCRγδ de superficie, redujo los niveles de [Ca2+]i basales en las iIELs γδ+CD8αα+ y γδ–CD8α+. Esta regulación negativa del complejo TCRγδ se asoció a una disminución en la funcionalidad de las iIELs γδ, debido a una refractariedad a la inducción de flujos de Ca2+ y producción de factores solubles en respuesta a la estimulación del complejo TCRγδ ex vivo. La activación del TCRγδ in vivo tendió a aumentar el porcentaje de células T efectoras CCR5+ sin afectar el contenido de Tregs CCR5+ en la LP. Además, el contenido de células Treg CCR5+ en la LP en ratones TCRd-/- demostró ser reducido significativamente. Estos resultados corresponden a los primeros estudios que han monitoreado directamente el estado de activación intracelular así como el flujo de Ca2+ en las iIELs γδ. También demuestran que la activación y subsecuente regulación negativa del complejo TCRγδ in vivo influye sobre los niveles de [Ca2+]i basal como en su movilización como también en la producción de CCL4 e IFN-γ. Por lo tanto, concluimos que la actividad y el nivel de expresión del TCR de las iIELs γδ son importantes para su funcionalidad. Estos resultados sugieren que las señales que toman contacto con el TCRγδ en las iIELs tienen una influencia sobre la composición de las células Treg y efectoras CCR5+ de la LP, posiblemente afectando la homeostasis de células T intestinales.

The intestinal intraepithelial lymphocytes (iIELs) are located in-between the enterocytes of the gut epithelium. They have an intrinsic high activation state characterized by the expression of CD69 and other activation markers. The γδTCR complex activation in iIELs induces cytolyic activity, IFN-γ production and reduction of TCR complex surface expression, being unknown the intracellular Ca2+ role in its signaling and function. On the other hand, it has been described that regulatory (Tregs) T cells capability to home to lamina propria is important in the maintenance of the intestinal immune tolerance. Thus, studies that showing the γδTCR role in terms of intracellular Ca2+ mobilization in iIELs and their relation with CCL4 chemokine expression were carried out, in which CCL4 has been shown to be associated with CCR5+ Tregs homing to different tissues. The γδ and αβ iIELs produce CCL4 and IFN-γ in a CD3/TCR- and Ca2+/PKCs dependent manner. CCL4 is transiently and principally produced in γδ iIELs but not in splenic γδ T cells. The increase in intracellular Ca2+ per se as well as TCR stimulation contributed to cellular activation and increased CCL4 and IFN-γ production ex vivo in γδ and αβ iIELs subpopulations, respectively. We found that the intracellular activation state based on basal [Ca2+]i in iIELs from γδ reporter mice (H2B-EGFP) is intrinsically high. However, [Ca2+]i amplitudes were lower than in systemic T cells, after ex vivo anti-CD3 or anti-γδ TCR (clone GL3) stimulation. The in vivo γδTCR complex activation in γδ reporter mice, that induces a γδTCR complex negative regulation, reduced the basal [Ca2+]i in γδ+CD8αα+ y γδ–CD8α iIELs. This γδTCR complex negative regulation is associated with a γδ iIELs functional reduction due to Ca2+ flux induction and soluble factor production refractariety through ex vivo γδ TCR complex activation. The in vivo γδTCR activation tended to increase the percentage of LP CCR5+ effector T cells without CCR5+ Treg percentage impairment. Moreover, in contrast to in vivo γδTCR activation, studies in Tcrd-/- mice showed a significantly lower percentage in LP CCR5+ Tregs. These results are the first studies that directly monitor the γδ iIEL’s intracellular activation state and Ca2+ flux in γδ iIELs. Furthermore, it was demonstrated that γδTCR complex negative regulation influenced the basal [Ca2+]i as well as CCL4 and IFN-γ production of γδ iIELs in vivo. Therefore, we conclude that the activity and expression levels of γδTCR in iIELs are important for their functionality. These results suggest that γδ TCR signals in iIELs have an influence on the composition of LP CCR5+ Tregs and effectors T cells and possibly affect the intestinal T cell homeostasis.