Caracterización funcional de la proteína RhoGEF3, posible intercambiador de nucleótidos de RhoGTPasas

Abstract

La morfogénesis en el embrión de Drosophila requiere de la organización tridimensional de poblaciones de células con formas y comportamientos característicos de las cuales surgirán las estructuras del animal adulto. Los cambios de forma y movimiento coordinados de estos grupos de células tienen su origen en la reorganización del citoesqueleto de actina. Este proceso se encuentra dirigido por una compleja red de señalizaciones y bajo el control de las Rho GTPasas, encargadas de organizar los filamentos de actina en estructuras especializadas de la célula. La actividad de las Rho GTPasas se encuentra, a su vez, finamente regulada a través de proteínas GAP (GTPase Activating Protein) y proteínas GEF (Guanine Exchange Factor), que modifican el estado de activación de las Rho GTPasas y permiten su articulación con diversas vías de señalización, siendo las responsables de dirigir temporal y espacialmente la acción de las GTPasas. En Drosophila existen 22 genes que codificarían para proteínas GEFs, de los cuales un numero reducido ha sido funcionalmente caracterizado durante el desarrollo, por lo que el estudio de estos genes y la caracterización de la función de sus productos proteicos parece fundamental para lograr una mayor comprensión de los mecanismos que regulan los cambios en la conducta celular durante la morfogénesis del epitelio embrionario. En este trabajo de tesis se propuso caracterizar molecular y funcionalmente un nuevo GEF de Drosophila, denominado RhoGEF3. Para ello se formuló la siguiente hipótesis: La función de la proteína RhoGEF3 otorga especificidad espacial y temporal a la respuesta mediada por GTPasas, lo que se traduce en una reorganización del citoesqueleto de actina durante las etapas tempranas del desarrollo embrionario de Drosophila. Para abordar esta hipótesis se plantearon tres objetivos específicos: (1) Determinar la secuencia completa del cDNA de rhogef3 y la expresión espacio-temporal de su transcrito y de su proteína; (2) Determinar in vitro la capacidad de la proteína RhoGEF3 de funcionar como intercambiador de nucleótidos de Rho GTPasas y de reorganizar el citoesqueleto de actina, y (3) Analizar el papel que cumple RhoGEF3 en estados tempranos del desarrollo, a través de la generación de mutantes de pérdida y ganancia de función. Nuestros resultados indican que el gen rhogef3 es diferencialmente expresado durante el desarrollo embrionario y su expresión se encuentra restringida en grupos particulares de células epiteliales. La generación de un anticuerpo anti-RhoGEF3 permitió detectar esta proteína en glándulas salivales, tráqueas y en el primordio del proctodeo. Esta proteína se localiza en la región apical de las células que componen la porción secretora de la glándula salival. Experimentos in vitro sugieren que la proteína RhoGEF3 promueve la disociación de GDP desde la GTPasa Rac1. Consistentemente, la expresión de RhoGEF3 es capaz de inducir el ensamblaje de estructuras similares a lamelas en cultivos de células S2 y S2R+ de Drosophila. La pérdida de función de esta proteína afecta la morfología de las células S2R+, de manera similar a la pérdida de función de la GTPasa Rac1, no así de las GTPasas Rho1 y Cdc42. Los resultados obtenidos siguieren que in vivo la proteína RhoGEF3 participa en la regulación espacial y temporal de la señalización mediada por GTPasas, particularmente en procesos de reorganización del citoesqueleto de actina, mediante la activación específica de la GTPasa Rac1. En experimentos en curso, estamos evaluando esta hipótesis en el contexto del desarrollo del embrión de Drosophila.

Morphogenesis in the Drosophila embryo requires the three-dimensional organization of cell populations with distinctive shapes and behaviors that that give rise to the adult structure of the animal. The changes in cell shape and the coordinated movement of these groups of cells relies on the reorganization of actin cytoskeleton. Reorganization of actin cytoskeleton is governed by complex signaling networks and controlled by of Rho GTPases, which are responsible of organizing actin filaments in specialized cellular structures. The activity of Rho GTPases is, in turn, finely regulated through GAP proteins (GTPase Activating Protein) and GEF proteins (Guanine Exchange Factor), which modulate the activation status of Rho GTPases and connect them with various signaling pathways, thus they are responsible of directing GTPase activities in a temporally and spatially coordinate manner. In Drosophila there are 22 genes that codify for GEF proteins, however only a small number of these putative GEFs has been functionally characterized during development. The study of these genes and the characterization of their protein products seem to an essential step to better understand the mechanisms that regulate changes in cell behavior during embryo morphogenesis. In this thesis work we undertook the molecular and functional characterization of new Drosophila GEF named as RhoGEF3. In doing so, we proposed the following hypothesis: The activity of RhoGEF3 endows with spatial and temporal specificity the cell response mediated by GTPases, affecting the reorganization of the actin cytoskeleton during early stages of embryonic development of Drosophila. The specific objectives were: (1) To determine the complete sequence of rhogef3 cDNA and the spatio-temporal pattern of expression of its transcript and its encoded protein, (2) To determine in vitro the capacity the RhoGEF3 to promote GDP/GTP exchange on RhoGTPases, and (3) To analyze the role of RhoGEF3 in early stages of embryo development through the generation of loss and gain of function mutants. Our results indicate that the rhogef3 gene is differentially expressed during embryonic development and its expression is restricted to particular groups of epithelial cells. The generation of an antibody against RhoGEF3 allowed detecting this protein in salivary glands, tracheae and in the hindgut primordium. RhoGEF is localized in the apical region of the cells that make up the secretory portion of salivary glands. In vitro experiments suggest that RhoGEF3 protein promotes the dissociation of GDP from the GTPase Rac1. Consistently, the expression of RhoGEF3 induces the assembly of lamellae-like structures in cultures of S2 and S2R+ Drosophila cells. The loss of function of this protein affects the morphology of S2R+ cells, in a way that resembles the loss of function of the GTPase Rac1, but not that of Rho1 and Cdc42 GTPases. The results suggest that RhoGEF3 protein is involved in spatial and temporal regulation of signaling mediated by GTPases, particularly in the reorganization of the actin cytoskeleton through the activation of the GTPase Rac1. In ongoing experiments, we are evaluating this hypothesis in the context of embryonic development of Drosophila.