Construcción de vacunas de ADN de Salmonella enterica serovar Enteritidis y evaluación de la repuesta inmune generada en un modelo murino

Abstract

Salmonella enterica serovar Enteritidis es el principal agente etiológico de la salmonelosis, una enfermedad de transmisión alimenticia que afecta a diversas especies animales y se transmite al hombre a través del consumo de productos avícolas contaminados, principalmente huevos. La salmonelosis constituye en la actualidad un problema global de salud pública y un riesgo importante para la economía asociada a la producción animal. Por este motivo se han desarrollado estrategias de control para S. Enteritidis que incluyen terapias antimicrobianas y vacunación de las aves de postura con bacterias muertas o atenuadas. Sin embargo, la creciente resistencia a antibióticos por parte de algunas cepas de Salmonella y la limitada eficacia de las vacunas existentes han impulsado el estudio de los mecanismos moleculares de patogenicidad de la bacteria para desarrollar nuevos métodos de control. La isla de patogenicidad ΦSE14 (presente sólo en S. Enteritidis) contiene 21 ORFs, dentro de los cuales se encuentra SEN1395, que codifica una proteína con dominios pertenecientes a una nueva superfamilia de lisozimas. Por su parte, la isla SPI-19 (presente en los serovares Enteritidis, Agona, Dublin y Gallinarum) contiene una serie de genes que codifican proteínas asociadas a un sistema de secreción tipo 6 (T6SS). Entre estos genes se encuentra SEN1002, que codifica la proteína Hcp que posee propiedades inmunogénicas. En este trabajo, se escogieron los genes SEN1002 y SEN1395 de S. enterica serovar Enteritidis para desarrollar vacunas de ADN. De esta manera, se postuló la hipótesis “Vacunas de ADN diseñadas a partir de los genes SEN1002 y SEN1395 de S. Enteritidis inducen una respuesta inmune protectora en ratones BALB/c”. Para construir las vacunas de ADN se amplificaron los ORFs y se clonaron en el vector comercial pVAX1 modificado por la inserción del gen que codifica el epítope 3xFlag (pVAX1-FLAG). Los ORFs SEN1002 y SEN1395 se clonaron de tal forma que este epítope quedara fusionado al extremo 3’ de las proteínas recombinantes, pudiendo ser detectadas con el anticuerpo comercial anti-Flag M2. Una vez construidas las vacunas, se detectó la producción de las proteínas recombinantes fusionadas a Flag (SEN1002/Flag y SEN1395/Flag) tanto en bacterias (E. coli BL21 (DE3)) como en células eucariontes (HEK293) mediante Westernblot, comprobándose la funcionalidad de los vectores. Las vacunas se probaron en un modelo in vivo (ratones BALB/c). Para esto, se inocularon seis ratones vía subcutánea, intramuscular e intranasal en las semanas cero, dos y tres del ensayo, respectivamente, con 100 μg de plasmidio o con PBS solo, mientras que la inoculación con bacterias se realizó vía oral con 108 unidades formadoras de colonias en los mismos tiempos. Al cabo de dos semanas se obtuvieron los bazos de los ratones inmunizados, se preparó una suspensión celular y posterior a la estimulación con SEN1002/Flag, SEN1395/Flag, PBS, vector vacío o lisado de bacteria, se midió la linfoproliferación mediante la incorporación de timidina tritiada (H3) y se cuantificó mediante ELISA la secreción de las citoquinas IFNγ e IL-4. Los resultados mostraron que en un cultivo in vitro de linfocitos obtenidos de ratones vacunados con pVAXFlag/SEN1002, se produjo un aumento en la proliferación luego de ser estimulados con la proteína SEN1002/Flag. En estos linfocitos, y también en los obtenidos de los ratones vacunados con pVAXFlag/SEN1395 (estimulados con SEN1395/Flag), se detectó un aumento considerable en los niveles de INFγ secretados, así como bajas cantidades de IL-4, demostrando que las construcciones son capaces de generar una respuesta inmune de tipo celular Th1. No obstante, en las condiciones estudiadas en este trabajo, esta respuesta no fue capaz de generar protección frente a un desafío con LK5 en ratones inmunizados.