Pharmacological evaluation of new meta- and para-hydroxyl substituted C-4-aryl-1,4-dihydropyridines in cardiomyocytes

Abstract

Los canales de calcio dependientes de voltaje son expresados ampliamente en todos los tejidos, incluyendo los del tejido cardiovascular. Ellos son la principal ruta para la entrada de calcio dentro de la célula. Estos canales son proteínas multiméricas que son compuestos por una subunidad principal, α1, que es la que forma el poro, y se asocia con otras subunidades denominadas auxiliares: α2δ, β and γ. Hay varios tipos de canales de calcio pero en las células ventriculares cardíacas se encuentran primordialmente los canales de calcio tipo L. Debido a su relevancia en enfermedades cardíacas; estos canales son el blanco de los bloqueadores de los canales de calcio. Los bloqueadores de los canales de calcio (CCBs) más utilizados, se clasifican en tres grandes clases; varían químicamente y exhiben diferentes efectos funcionales que dependen de sus interacciones tanto conformacionales como biofísicas con la subunidad α1 del canal. Aunque al inicio de su uso farmacológico fenilalquilaminas (verapamilo); benzotiazepinas (diltiazem) y dihidropiridinas (nitrendipino), mostraban una actividad cardiodepresora parecida, el desarrollo de nuevos bloqueadores parece haberse centrado en las dihidropiridinas (DHPs), las cuales han evolucionado desde una primera hasta una tercera generación, siendo los miembros de ésta última bloqueadores igualmente potentes además de que tienen reportada actividad antioxidante, lo cual ofrece un mayor beneficio terapéutico, máxime con la relevancia que está adquiriendo el estrés oxidativo en enfermedades cardiovasculares como la hipertensión; donde las especies reactivas de oxígeno tienen efectos deletéreos debido a su interacción con sistemas de transporte iónico en la membrana plasmática. El objetivo de esta tesis fue investigar la potencia bloqueadora del canal de calcio como también propiedades antioxidantes de nuevas dihidropiridinas. Estas presentaban sustituciones que no han sido reportadas en el anillo fenil, como un grupo hidroxilo; primero en una mono-sustitución en meta y en para, respectivamente, y una di-sustituida en posición meta; segundo, una vainillina con un grupo hidroxilo en posición meta y un grupo carboxi en posición para, junto con su isómero; además de arilo sin sustituciones. Estas moléculas no reportadas se compararon frente a nitrendipino. Se empleó microscopía confocal en su modo line scan y patch clamp, también en este mismo modo para investigar su antagonismo de Ca2+; para medir su capacidad antioxidante se usaron además de la microscopía confocal, la citometría de flujo, ésta última también fue utilizada para evaluar tanto la toxicidad celular como sus propiedades antioxidantes. Ninguno de los compuestos demostró tener efectos tóxicos relevantes luego de un periodo de incubación de 24 horas en cardiomiocitos. Nuestros resultados indican que estos efectos no fueron significativamente diferentes de aquellos del compuesto control, nitrendipino (NIT). Entonces los efectos farmacológicos observados son el resultado de los mismos compuestos y no de un efecto tóxico. Sólo una de las nuevas DHPs exhibió un efecto bloqueador sobre los canales de calcio tipo L en cardiomiocitos, meta sustituido con un hidroxilo (3-OH-DHP), en todas las concentraciones en que fue probada, mientras que la que presentaba el arilo sin sustituciones, solo tuvo este efecto cuando se ensayó en su concentración más alta (10 μM). Los resultados obtenidos con patch clamp para 3-OH-DHP a concentraciones inferiores a 0.1 μM, confirman este efecto antagonista. Ninguno de los compuestos pareció tener actividad antioxidante en los experimentos realizados en cardiomiocitos de rata neonata. Nuestra investigación llevó a varios logros, primero, y de acuerdo con lo que establece la literatura cualquier sustitución en para del arilo disminuye ostensiblemente o anula el efecto bloqueador de las DHPs sobre los CCTL. Segundo, el anillo arilo sin sustituciones es farmacóforo pero requiere de un sustituyente adecuado para esperar un efecto bloqueador. Tercero, a pesar de las similitudes estructurales entre el compuesto sustituido con un hidroxilo en meta y el bisustituido en la misma posición, solo el primero tuvo un efecto sobre los canales; probablemente esta diferencia se deba a un impedimento estérico. En lo referente a los estudios sobre ROS, se puede inferir que se requiere un sustituyente voluminoso en C2 ó C3 del anillo dihidropiridinico para lograr actividad antioxidante.

Voltage-dependent calcium channels are widely expressed throughout the different tissues, including those from the cardiovascular system. They constitute the main route for calcium entry. Voltage gated calcium channels are multimeric proteins that consist of a principal pore forming α1 subunit in association with auxiliary subunits. There are various types of voltage dependent calcium channels but in cardiomyocytes predominantly the L-type calcium channels is found. Due to the relevance of the L-type calcium channel in cardiac diseases; these channels are the primary target of the calcium channel blockers. Commonly used calcium channels blockers (CCBs) are classified onto three major classes; they vary chemically, and exhibit different functional effects depending on their biophysical, conformation-dependent interactions with the L-type channel in the α1. Even though at the beginning of their pharmacological use the phenylalkylamines (diltiazem), the benzothiazepines (verapamil) and the dihydropyridines (nitrendipine), exhibited a somehow similar cardiodepressant activity, the development of new calcium channel blockers seems to have centered in the DHPs which have evolved from a first until a third generation, being the members of this last generation equally potent blockers, and some of them with a reported antioxidant activity, which offers therapeutic benefits based upon the acquiring relevance of oxidative stress in cardiovascular diseases such as hypertension; where reactive oxygen species have deleterious effects due to their interaction with ion transport systems in the plasma membrane. The aim of this thesis was to explore the calcium channel blocking as well as antioxidant properties, and cell toxicity of novel DHPs. These presented unreported substitutions in the phenyl ring, such as a hydroxyl group, mono substituted, in meta and para, respectively; then disubstituted in meta; a vanillin with and hydroxyl group in meta and a carboxy group in para and its isomer; besides an unsubstituted aryl ring. These unreported molecules were all compared to nitrendipine. We used confocal microscopy in the line scan and patch clamp in the whole cell mode to test Ca2+ antagonism. Antioxidant activity was also measured through confocal microscopy; and flow cytometry, the latter was also applied to assess cell toxicity and antioxidant properties. None of the compounds exhibited significant toxic effects after a 24 hour incubation period, tested on neonatal ventricular myocytes. Our results indicated that these effects were not significantly different from the drug control, nitrendipine (NIT). In consequence, the pharmacological effects here found are the outcome of the DHPs themselves and not because of a toxic side effect. Doing a quick recap, only one of the novel DHPs exhibited a blocking effect on LTCCs on adult rat cardiomyocytes, the hydroxyl meta substituted (3-OH-DHP), at all three concentrations tested whilst the one with the unsubstituted aryl had a blocking effect only at its highest concentration. Patch clamp results for 3-OH-DHP at concentrations lower than 0.1 μM also confirm this antagonizing effect. None of the compounds seemed to possess an antioxidant activity in the tests performed on cultured rat cardiomyocytes. Concerning the studies on ROS, it can be inferred, that a bulky substituent in C2 or C3 on the dihydropyridine ring, is relevant to achieve an antioxidant effect. Our research led to several accomplishments, first, and in agreement with the literature, that any para substitution in the aryl ring abolishes or nullifies the LTCC blocking effect of DHPs. Second, the unsubsituted aryl ring it is a pharmacophore, but it requires an adequate substitution to expect calcium channel blocking effect. Third, despite the structural similarity between a meta-hydroxy-substituted and a meta-dihydroxy- substituted aryl ring, only the former had an effect on the channels; probably this difference can be attributed to a steric effects.