Estudio de inclusión de derivados de catequina en ciclodextrina : actividad antioxidante y estabilidad

Abstract

En esta tesis se estudiaron los complejos de inclusión de derivados de catequina (catequina, epigalocatequina, epigalocatequina galato y galocatequina galato) con tres tipos de ciclodextrina (β-ciclodextrina, 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina y Heptakis(2,6-Di-O-metil)-β-ciclodextrina) para evaluar su actividad antioxidante y estabilidad, comparándolas con sus respectivos flavonoides libres. En primer lugar, se desarrolló un estudio termodinámico a partir de la determinación de sus constantes de asociación a distintas temperaturas, mediante espectroscopia de fluorescencia molecular. Los resultados obtenidos indicaron que el proceso de complejación está controlado principalmente por interacciones de tipo van der Waals, las que a su vez se ven complementadas por interacciones de tipo hidrofóbicas. La geometría de inclusión de estos complejos fue determinada mediante estudios de RMN utilizando metodologías ROESY-2D y ROESY selectivo, los cuales indicaron que la mayoría de las TC orientaron sus grupos catecol, pirogalol y galoil (según corresponda), hacia la abertura secundaria de las ciclodextrinas. Mediante estudios de modelación molecular realizados con el programa Autodock, se racionalizaron las geometrías de inclusión determinadas por RMN y se estimaron los grados de exposición de los grupos antioxidantes de las TC. Esta información explicó la actividad antioxidante demostrada para cada complejo de inclusión. Ensayos ORAC fueron utilizados para determinar la actividad y reactividad de los complejos de inclusión y sus respectivas TC frente a radicales peroxilo. Estos estudios fueron complementados con estudios de reactividad frente al radical hidroxilo mediante estudios de spin trapping por ESR. Los resultados indicaron una mantención e incluso un aumento de la reactividad de los complejos con respecto a sus respectivas TC libres, destacando los complejos formados con HPβCD. Estos resultados fueron explicados por la formación de una semiquinona radical más estable al formar parte de un complejo con ciclodextrina. Estas especies semiquinónicas fueron caracterizadas mediante estudios ESR, los cuales demostraron concordancia con las geometrías de inclusión obtenidas por RMN y Autodock. Los estudios de estabilidad de las TC en presencia de acido cítrico, ácido ascórbico y sacarosa, componentes utilizados en la industria alimentaria, fueron realizados mediante HPLC; demostrando que las ciclodextrinas aumentan la estabilidad de estos flavonoides. La protección producto de la inclusión en ciclodextrinas es efectiva a temperaturas moderadas, ya que se comprobó que a altas temperaturas el efecto protector de las ciclodextrinas se ve prácticamente anulado, debido a que el proceso de inclusión se ve desfavorecido.

This thesis studied the inclusion complexes of catechin derivatives (catechin, epigallocatechin, epigallocatechin gallate and gallocatechin gallate), with β- cyclodextrin and two of its derivatives (Heptakis 2,6-di-O-methyl-β-cyclodextrin and 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin) to evaluate its antioxidant activity and stability in comparison with their respective free flavonoids. In a first stage, we developed a thermodynamic study based on the determination of association constants at different temperatures by molecular fluorescence spectroscopy. The results indicated that the complexation process is mainly driven by van der Waals interactions, which were complemented by hydrophobic interactions. The inclusion geometry of these complexes was determined by NMR studies using 2D-ROESY and selective ROESY methodologies, which indicated that the catechol, pyrogallol and galloyl groups of the catechin derivatives (TC) were oriented to the secondary rim of the different cyclodextrins used. The inclusion geometries determinated by NMR were rationalized and the exposure degrees of antioxidant groups of TC were estimated by molecular modeling studies, which were performed with Autodock program. This information was useful to explain the antioxidant activity for each inclusion complex. ORAC assays were used to determinate the activity and reactivity of the inclusion complexes and their respective TC, against peroxyl radicals. These studies were complemented with another reactivity studies against hydroxyl free radical, using spin trapping methodology by ESR. These results indicate the maintenance or even an increase in the reactivity of the complexes respect to their free TC. This was explained by the formation of stable semiquinone radical species into the cyclodextrins cavities. Also the semiquinones were characterized by ESR studies, which were in agreement with the inclusion geometry determinated by NMR and Autodock methodologies. Finally, stability studies of the TC in the presence of citric acid, ascorbic acid and sucrose, compounds used in the food industry, were done by HPLC. The results show an increase in the stability of the flavonoids in presence of cyclodextrins. This protection caused by the inclusion in cyclodextrins was effective at moderate temperatures. This was verified through high temperatures stability assays, which indicate that the protection by cyclodextrins was not effective, due to that the inclusion process was not favorable.