Enzimas lipolíticas de krill antártico : purificación y caracterización, ¿enzimas adaptadas al frío?

Abstract

La temperatura es uno de los factores ambientales más importantes para la vida, siendo los ambientes fríos los que presentan la mayor distribución en la biosfera. Diferentes organismos han desarrollado diversas estrategias de tolerancia y adaptación al frío, entre ellas la síntesis de enzimas adaptadas/activas a bajas temperaturas. Estas enzimas especializadas se caracterizan por una alta eficiencia catalítica, temperaturas óptimas desplazadas a bajas temperaturas y termolabilidad a temperaturas moderadas. La disponibilidad del krill antártico, pequeño crustáceo explotado con fines comerciales, ha permitido el estudio de sus actividades enzimáticas. En el Centro de Ingeniería Bioquímica y Biotecnología los estudios se han centrado principalmente en la actividad proteasa y lipasa. Las enzimas lipolíticas están involucradas en le metabolismo lipídico, siendo las lipasas responsables de la hidrólisis y síntesis de triacilgliceroles. Basados en estos antecedentes se propone la siguiente hipótesis de trabajo: “el krill antártico Eupausia superba Dana posee enzimas lipolíticas adaptadas al frío, capaces de actuar in vitro a bajas temperaturas”, para el abordaje de esta hipótesis se desarrollaron tres objetivos específicos: (i) separación y obtención de enzimas lipolíticas de krill antártico, (ii) determinación de las características bioquímicas y fisicoquímicas de las enzimas lipolíticas purificadas y (iii) secuenciación y análisis de las secuencias de las enzimas lipolíticas de krill antártico. Se examinaron las condiciones para la obtención de un adecuado extracto enzimático, el procedimiento de autólisis a 40ºC durante 24 h o la homogenización a 8.300 rpm durante 1-2 min a 4ºC, permitió la obtención de un extracto con alta actividad lipasa específica. Se trabajó con dos enzimas lipolíticas de krill antártico, KL1 y KL2. La enzima lipolítica purificad KL1 presentó una masa molecular de 50 kDa y pI de 6,6 con una actividad sobre p-nitrofenilpalmitato (C16) de 2,9*103 U/mg a 20ºC y pH 8, presentó una temperatura óptima de 40ºC y pH óptimo de 9.KL1 exhibió un comportamiento inusual a temperaturas moderadas, sin embargo, a 10ºC retuvo el 23% de su actividad máxima, Se determinó una energía de activación de 24,7 kcal/mol (25-40ºC). Adicionalmente se caracterizó la enzima lipolítica KL2 previamente purificada que presentó una temperatura óptima a 37ºC y pH óptimo de 8, retuvo el 46% de su actividad máxima a 10ºC, Se determinó una energía de activación de 4,9 kcal/mol (10-37ºC). Las características de KL1 indiacarían que corresponde a una enzima mesofílica, en cambio, KL2 presentaría las propiedades de adaptación al frío (baja energía de activación y actividad a bajas temperaturas). El análisis de las secuencias de lipasas eucariontes realizado para el diseño de partidores para la identificación y ampliación PCR de genes de lipasa de krill antártico indicó que las lipasas presentan una baja similitud entre sus secuencias aminoácidos conservados contiguos y la peque ña longitud de las zonas conservadas, El análisis de las secuencias amplificadas por PCR no indicó similitud con lipasas. De igual modo el análisis de la secuencia parcial de KL2 tampoco mostró similitud significativa con lipasas, La ausencia de similitud probablemente se debería a las características antes señaladas de las lipasas, como también la posibilidad que correspondan a nuevas lipasas.