Inhibición de la síntesis de glutatión como estrategia para potenciar el efecto de drogas antichagásicas en modelos in vitro e in vivo de la enfermedad de Chagas

Abstract

La enfermedad de Chagas constituye uno de los principales problemas en salud pública en América Latina. Las drogas disponibles en la actualidad para el tratamiento, Nifurtimox y Benznidazol no presentan una respuesta clínica satisfactoria. El mecanismo de acción de estas drogas es mediante la generación de radicales libres y/o metabolitos electrofílicos. Al respecto, el Glutatión (GSH) y su conjugado con espermidina, Tripanotión (T(SH)2), constituyen los principales mecanismos de defensa antioxidante del parásito. L-Butionina-(S,R)-Sulfoximina (BSO) inhibe la síntesis de GSH y (T(SH)2), y potencia el efecto tripanocida del Nifurtimox y Benznidazol en modelos in vitro de la enfermedad de Chagas. A dosis de 500 µM de BSO se observa una disminución de más de un 80% de tioles en todas las formas del parásito. En epimastigotes, BSO 500 µM disminuyó los ICKc50 (dosis inhibitoria 50 para la constante de crecimiento) de Nifurtimox o Benznidazol en un 60%, resultado similar se observó al evaluar la viabilidad de los epimastigotes midiendo la reducción de MTT ([3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolium bromuro). Al tratar tripomastigotes de Trypanosoma cruzi con BSO 500 µM y Nifurtimox se observó una disminución del IC50 medido por la reducción de MTT de 7,68 µM a 3,01 µM y al asociar Benznidazol con BSO 500 µM el IC50 disminuyó de 33,07 a 3,84 µM. En células Vero infectadas con amastigotes, BSO 25 µM fue capaz de potenciar el efecto de Nifurtimox y Benznidazol. Nifurtimox a concentración de 0,5 µM, el índice endocítico (porcentaje de células infectadas multiplicado por el promedio de amastigotes intracelulares) disminuyó de 2.500 a 980 cuando se agregó BSO 25 µM. Un resultado similar se observó cuando se asoció Benznidazol con BSO 25 µM. En ratones infectados con Trypanosoma cruzi, el tratamiento sólo con BSO, no aumentó la sobrevida de los animales; no obstante a ello, se observa una disminución significativa de la parasitemia a la dosis de BSO 1000 µmoles/Kg/día. Al asociar esta dosis de BSO con Nifurtimox o Benznidazol, no se observa un aumento en la sobrevida o una disminución significativa en las parasitemias. Los resultados in vitro, indican que la potenciación de Nifurtimox o Benznidazol por BSO podría disminuir las dosis clínicas de ambas drogas y disminuir los efectos secundarios o la duración de la terapia, no obstante los resultados in vivo no se orientan en el mismo sentido.

Chagas’ disease is a major parasitic cause of death and hardship, especially in the poor regions of the developing world. The current drugs: Nifurtimox and Benznidazole, are unsatisfactory for treatment. These drugs act through the formation of free radicals and/or electrophilic metabolites, and Glutathione and its spermidine conjugated, Trypanothione are the main antioxidant defense mechanisms of the parasite. The Glutathione synthesis inhibition with L-Buthionine (S,R)-sulfoximine (BSO) increased Nifurtimox and Benznidazole toxicity against epimastigote, trypomastigote, and amastigote forms of Trypanosoma cruzi. 500 μM BSO decreased total glutathione-derived thiols by 70 to 80% in 48 h. In epimastigotes, 500 μM BSO decreased the concentration of Nifurtimox o Benznidazole needed to reduce the parasites’s growth constant (ICKc50) by 60%. The survival of epimastigotes treated with Nifurtimox or Benznidazole, as measured by MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) reduction, was significantly decreased by 500 μM BSO. Trypomastigotes treated with 500 μM BSO decreased the IC50 of Nifurtimox measured by MTT reduction, from 7.68 μM to 3.01 μM and that of Benznidazole from 33.07 to 3.84 μM. In Vero cells infected with amastigotes, 25 μM BSO was able to potentiate the effect of Nifurtimox and Benznidazole. At 0.5 μM Nifurtimox, the endocytic index (percentage of infected Vero cells multiplied by the average number of intracellular amastigotes) decreased from 2,500 to 980 when 25 μM BSO was added. A similar result was observed with the Benznidazole-BSO combination. In BALB/c mice infected with Trypanosome cruzi, the treatment with only BSO did not increase animals survival; however a significant decrease of parasitemias was observed, with a BSO dose of 1000 μmol/Kg/day. This dose associated with Nifurtimox or Benznidazole, do not show an increase in the survival rate or a decrease in the parasitemia. In vitro results indicate that potentiation of Nifurtimox or Benznidazole by BSO could decrease the clinical dose of both drugs and decrease to the side effects or therapy length. However the in vivo results do not lead to the same conclusion.