Desarrollo, validación y aplicación de ensayos analíticos para péptidos y proteínas, farmacológicamente activas, utilizando cromatografía líquida de alta resolución

Abstract

Hoy en día la validación de los métodos analíticos es más que una necesidad: es una exigencia y una práctica necesaria en todos los laboratorios de análisis que pretendan garantizar la calidad de los productos que elaboran. La validación es el proceso que permite verificar que un método es adecuado, para resolver un problema analítico particular, incluso es necesaria la validación de métodos considerados oficiales, ya sea en forma parcial o completa, como única forma de conocer los parámetros exigidos en una validación analítica. En este trabajo la siguiente hipótesis fue examinada: aplicando cromatografía líquida de alta resolución con detector UV y seleccionando adecuadamente las columnas cromatográficas, es posible desarrollar metodologías analíticas sencillas, rápidas y específicas para cuantificar fármacos de naturaleza polipeptídica en formas farmacéuticas. Consecuentemente los objetivos específicos de este trabajo fueron: estudiar las condiciones experimentales para el desarrollo y validación por HPLC para métodos de análisis para insulina humana, insulina lispro, desmopresina y calcitonina en sus respectivas formas farmacéuticas. En el rango de péptidos estudiados no se encontraron grandes problemas de estabilidad que obligaran a tomar precauciones especiales en el manejo de las muestras, pero sin duda esto más bien recae en las características particulares de cada péptido y no se puede generalizar, pero sí se puede asegurar que la insulina humana, la insulina lispro, la calcitonina y la desmopresina, se mantienen estables por varios días, incluso a temperatura ambiente, disueltas en los solventes indicados en cada metodología, parte de este trabajo. El empleo de columnas apropiadas, para péptidos de alto peso molecular, como calcitonina e insulinas, columnas largas y de cadena corta C-4 o C-8 con un tamaño de poro sobre 100 A°, por ejemplo de 300 A°, permite montar técnicas analíticas , confiables, de buena resolución y rápido desarrollo, absolutamente validables para su empleo en análisis de rutina en productos farmacéuticos que contengan estas moléculas. Se estableció un método preciso y confiable, para el análisis de todos los péptidos estudiados: insulina humana, insulina lispro, calcitonina y desmopresina , para ser aplicada en su forma farmacéutica comercial. Se estudiaron todos los parámetros involucrados en la validación de cada una de las metodologías analíticas, para cada uno de los péptidos involucrados en el estudio, logrando finalmente validar los métodos de análisis. La experiencia lograda en el manejo de solventes adecuados, para disolver las muestras y para formar las fases móviles, como también el tipo de columna (relleno y largo), sin duda permitirá el desarrollo más rápido y la validación de técnicas analíticas para otros péptidos que se deseen evaluar en el futuro.

Nowadays, the validation of analytical methods is more than a necessity. It’s a mandatory practice in every laboratory of analysis in order to guarantee the quality of the products manufactured by the pharmaceutical industry. Validation is the process that allows to verify if a specific method is appropriate to solve an specific analytical problem. Partial or complete validation of official compendial methods is also necessary as the only way to establish the parameters of an analytical validation. In this work the following hypothesis was tested: using high performance liquid chromatography with UV detection and making an appropriate selection of chromatographic columns, is possible the development and validation of simple, fast and specific analytical methods in order to quantify peptidic drugs in pharmaceutical dosage forms. Consecuently, the specific aims of this work were: to study the experimental conditions for the development and validation of HPLC methods for the assay of human insulin, lispro insulin, desmopresin and calcitonin in pharmaceutical dosage forms. No stability problems were found in the peptides studied in this work, therefore no special precautions in sample handling were needed. Undoubtedly, this behavior is attributable to the characteristics of each peptide. It is not possible to make a generalization, but we can assert that human insulin, lispro insulin, calcitonin and desmopresin remain stable for several days at room temperature in the solvents indicated in each methodology for each drug. The use of appropriate columns for high molecular weight peptides as Calcitonin and Insulin, long and short chain, C-4 or C-8, with a pore size over 100 Aº (specifically 300 Aº, used in this work) allowed the development of reliable analytical techniques, on times according to the needs of a high demanding work quality control laboratory. The analytical techniques developed in this work for Human Insulin, Lispro Insulin, Calcitonin and Desmopresin were validated for its use in routine analysis of the pharmaceutical products containing those peptides. All the parameters involved in the validation of the analytical methodology, according the USP Category I classification, were established for each drug. Additionally, detection and quantitation limits were determined. The experience obtained in the handling of adequate solvents to dissolve the samples and to form the mobile phases and the type of column (filling and length) will allow a faster development and validation of analytical techniques for other peptides in the future.