DT-diaforasa impide la formación de oligómeros de α-sinucleína inducida por aminocromo

Abstract

La agregación de α-sinucleína se ha relacionado por varios autores con la enfermedad de parkinson. Recientemente, se ha evidenciado por estudios in vitro que la dopamina al oxidarse induce la agregación de α-sinucleína a estructuras protofibrilares neurotóxicas, inhibiendo la formación de fibras de a- sinucleína, mecanismo que se ha relacionado con la detoxificación de las protofibras. Antecedentes sugieren que es el aminocromo, un derivado de la oxidación de la dopamina, el responsable de estas acciones. Sin embargo, todos los experimentos con aminocromo han sido realizados en presencia de dopamina y agentes oxidantes. En esta tesis se intentó demostrar por estudios in vitro que: (i) El aminocromo puro puede inducir la agregación de a-sinucleína a protofibras, inhibiendo la formación de fibras. (ii) La reducción de este aminocromo por la enzima DT-diaforasa es un mecanismo protector que previene la formación de protofibras de a-sinucleína. En esta tesis se desarrolló un método nuevo para purificar aminocromo usando cromatografía de intercambio iónico. Para demostrar que el aminocromo fue separado de dopamina y agentes oxidantes, usamos espectroscopía UV-visible y 1H-NMR. El aminocromo se incubó con a- sinucleína en distintas condiciones, observando: (i) agregación de a-sinucleína a estructuras oligoméricas (precursoras de protofibras) por Western blot, microscopía electrónica y dicroísmo circular y (ii) inhibición de fibrilación de a- sinucleína, determinado por fluorescencia con tioflavina T, dicroísmo circular y microscopía electrónica. Finalmente, se incubó aminocromo y a-sinucleína en presencia de DT-diaforasa y se observó inhibición de la agregación de a- sinucleína tanto a oligómeros como a fibras. Esta inhibición de la agregación de a-sinucleína fue determinado por Western blot, microscopía electrónica, fluorescencia con tioflavina T y dicroísmo circular. Además, se demostró que al reducir aminocromo con un electrón por otra flavoenzima solo se disminuyó levemente la agregación de a-sinucleína inducida por aminocromo.

The aggregation of α-synuclein have been related with Parkinson´s disease for many scientifics. Recently, many in vitro studies have produced evidences that the oxidation of dopamine induces the aggregation of α- synuclein to neurotoxic protofibers and inhibits the fibrilization a-synuclein, mechanisms which prevent the protofibrils formation. There are antecedents sugesting that aminochrome, a product derived of the oxidation of dopamine, is the responsible of this process. However, all the experiments with aminochrome have been performed in the presence of dopamine and oxidizing agents. The aim of this thesis was to demostrate with in vitro studies that: (i) The aminochrome can induce the aggregation of a-synuclein to protofibers, inhibiting the fibrils formation. (ii) The reduction of aminochrome by DT-diaphorase is a protective mechanism to the formation of protofibers of a-synuclein. In this thesis was developed a new method to purify aminochrome by using ionic interchange chromatography. To demostrate that the aminochrome was separated from dopamine and oxiding agents, we used UV-visible spectroscopy and 1H-NMR. The aminochore was incubated with a-synuclein in different conditions, detecting: (i) aggregation of a-synuclein to oligomers (precursors of the protofibrils) for Western blot, electronic microscopy and circular dicroism and (ii) inhibition of a-synuclein fibrilization detected with tioflavine T fluorescence, circular dicroism and electronic microscopy. Finally, a-synuclein and pure aminochrome was incubated with DT-diaphorase, showing that the aggregation of a-synuclein to both, protofibers and fibrils was inhibited determined by Western blot, tioflavine T fluorescence, circular dicroism and electronic microscopy. Moreover, it was observed that the reduction of aminochrome with one electron only decrease the aggregation of a-synuclein induced for aminochrome.