Identificación de regiones regulatorias del gen dlg de Drosophila melanogaster
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2008Metadata
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Sierralta Jara, Jimena
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Identificación de regiones regulatorias del gen dlg de Drosophila melanogaster
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La diferenciación celular ocurre debido a la regulación de la expresión de distintos genes en un patrón espacial y temporal definido. Entre los elementos regulatorios de la expresión a nivel de transcripción de genes se encuentran los promotores, que poseen elementos basales para la transcripción, elementos proximales que la regulan río arriba de este, y los elementos distales que son capaces de regular la expresión de un gen aún estando muy lejos del promotor, incluso río abajo de éste. Los elementos basales de los promotores son capaces de unir factores de transcripción generales en todas las células, en cambio los elementos distales unen factores específicos de cada célula, regulando de esta manera la expresión tejido específica.
Las proteínas de andamio participan en funciones vitales, como el mantenimiento de la localización adecuada de las proteínas de membrana en células pre y post sinápticas, para que ocurra la neurotransmisión o para mantener la estabilidad de polaridad epitelial. La proteína DLG o Discs large es miembro de una familia de proteínas asociadas a membrana homólogas a guanilato kinasa (MAGUK). A través de sus dominios, las proteínas MAGUK reclutan receptores, canales iónicos, componentes de cascadas de transducción de señales y proteínas del citoesqueleto.
El producto del gen dlg, identificado como supresor de tumores en Drosophila melanogaster cumple un rol fundamental tanto en células epiteliales como en células neuronales. En las células epiteliales mantiene la polaridad ápico-basal y controla la proliferación, y en la sinapsis regula la estructura de los botones sinápticos durante el desarrollo. Se han localizado diversos dominios codificados por dlg en tipos celulares diferentes, como lo es S97N, que se expresa predominantemente en el cordón ventral y en la unión neuromuscular de embriones y larvas tardías, pero no en las células epiteliales. La variante de expresión no neural corresponde a DLGA.
Debido a que existen transcritos de expresión tejido específica de dlg, resulta interesante identificar las secuencias que determinan los productos epiteliales o bien neuronales. Para esto identificamos dos posibles zonas regulatorias que podrían definir esta diferenciación basándonos en la conservación de su secuencia entre especies, y su susceptibilidad a la inserción de elementos P. Una de estas zonas es una secuencia de 4200 pb que se ubica río arriba de DLGS97 y la otra es una secuencia de 1900 pb que está río arriba de DLGA. Luego de amplificarlas por PCR se clonaron estas regiones en vectores para producir organismos transgénicos de Drosophila.
Tras un análisis por inmunohistoquímica de estas moscas modificadas genéticamente, encontramos que la secuencia río arriba del inicio de transcripción de DLGA dirige la expresión neuronal en todo el cerebro, y que la secuencia río arriba del inicio de transcripción de DLGS97 dirige la expresión no neuronal, en zonas muy acotadas del cerebro. Ambas secuencias dirigieron la expresión desde el estadio larval, expresión que se mantuvo en el adulto.
Dado que estas secuencias fueron capaces de dirigir la transcripción del gen reportero que codifica la proteína fluorescente verde (GFP), las calificamos como “enhancers” o potenciadores de la transcripción. Cellular differentiation occurs due to the regulation of the gene expression in a defined temporal and spatial pattern. Among the gene expression regulatory elements at transcriptional level, are the promoters, which posses basal transcriptional elements, proximal upstream elements that regulate the activity of the promoter, and distant elements that are capable to regulate the gene expression far from the promoter and even downstream of the promoter. Basal elements of promoters bind general transcription factors in all cells, on the other hand, while distant elements bind specific factors of each cell type, regulating tissue specific expression in this way.
Scaffold proteins are required for vital functions, such as maintaining the localization of membrane proteins in pre and post-synaptic cells, for neurotransmission or for epithelial polarity stability. DLG or Discs Large protein is a member of membrane associated proteins homologous to guanylate kinase (MAGUK). By means of their interaction domains MAGUK proteins recruit receptors, ionic channels, signals transduction cascade components and cytoskeleton proteins.
The product of the dlg gene was identified as a tumour suppressor in Drosophila melanogaster, and has a fundamental role in epithelial cells and in neurons. In epithelial cells DLG protein controls apico-basal polarity and proliferation, and in synapses it regulates the synaptic button structure during development. Many domains encoded by dlg in different cell types have been identified, as S97N, which is predominantly expressed in the ventral cord and in the neuromuscular junction in embryos and late larval stages, but not in epithelial cells. The non-neural variant corresponds to DLGA.
The existence of tissue specific transcripts, makes it interesting to identify regulatory sequences that determine epithelial or neuronal products. We identified two possible regions based on their inter species sequence conservation, and their susceptibility to harbour P elements insertion. One sequence (4200 pb) is upstream of DLGS97 and the other (1900 pb) is upstream of DLGA. We amplified these sequences by PCR, and cloned them in vectors suitable to produce transgenic flies.
After immuno-histochemical analysis of the transgenic flies we found that the sequence upstream of the transcriptional start of DLGA directs partially neuronal expression in all the brain, and that the sequence upstream of DLGS97 directs non-neuronal expression, in a small region of the brain. Both sequences directed expression in the brain from larval stageto adult brain.
Since these sequences were capable to direct GFP transcription we assigned them a transcriptional enhancer role.
Identifier
URI: https://repositorio.uchile.cl/handle/2250/105260
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