Expresión de HSP70 y HMOX-1 en miotubos de rata sometidos a despolarización : participación de la señal lenta de calcio

Abstract

El musculo esquelético es un tejido de gran plasticidad, capaz de responder y adaptarse a los desafíos físicos y metabólicos impuestos por la actividad contráctil. La respuesta adaptativa, que incluye procesos que llevan a hipertrofia y activación de mecanismos antioxidativos, ha sido asociada a cambios transitorios en la actividad transcripcional de genes específicos.

Nuestro laboratorio ha determinado, mediante análisis de microarreglos, que la despolarización con alta concentración de K+ altera la expresión de un número limitado de genes, relacionados principalmente con respuesta a estrés y metabolismo. Los mayores cambios de expresión observados corresponden a los genes que codifican para la Proteína de Shock Térmico 70 (Hsp70) y para Heme Oxigenasa I (Hmox-1).

En el musculo esquelético Hsp70 y Hmox-1 son inducidas por una variedad de estímulos estresantes. Hsp70 actúa como chaperona molecular participando en la síntesis, translocación y degradación de proteínas durante episodios de estrés. Además ha sido involucrada en la adaptación hipertrófica, facilitando el apropiado plegamiento de proteínas sintetizadas de novo. Se ha descrito que Hmox-1 ejerce un efecto protector frente al daño ocasionado por radicales libres en varios tejidos, ejerciendo una acción antioxidante durante la contracción muscular.

Se desconoce la vía de señalización que lleva a la expresión de Hsp70 y Hmox-1 en el musculo esquelético en respuesta al ejercicio, pero existen evidencias que sugieren que los cambios en la concentración intracelular de Ca2+ estarían participando en este proceso. Estudios previos en células musculares esqueléticas han demostrado que el aumento en la concentración de Ca2+ intracelular, inducida por despolarización, es un evento complejo de al menos dos componentes con cinéticas diferentes. Después de una señal rápida de Ca2+ asociada al acoplamiento excitación-contracción, se presenta una señal lenta de Ca2+, dependiente de inositol-1,4,5-trifosfato (IP3), principalmente asociada a los núcleos celulares. Nuestro grupo ha demostrado que la señal lenta de Ca2+, inducida por despolarización, está involucrada en los eventos tempranos que regulan la expresión génica.

El objetivo principal de esta tesis fue investigar los mecanismos moleculares involucrados en la expresión de Hsp70 y Hmox-1 en miotubos de rata sometidos a despolarización.

Demostramos que la despolarización induce la expresión de las proteínas Hsp70 y Hmox-1 a las 4 y 6 horas respectivamente, lo que está de acuerdo con los resultados obtenidos por microarreglos. Además observamos un aumento transitorio en el nivel de mRNA de Hsp70, con un máximo a las 2 horas después de despolarizar las células con una alta concentración de K+ o mediante estimulo eléctrico. Este incremento en el nivel de mRNA de Hsp70 es independiente de Ca2+ extracelular. Tanto el quelante de Ca2+ intracelular BAPTA-AM como los inhibidores de la señal lenta de Ca2+, 2-APB y LY294002, disminuyen la expresión del mRNA de Hsp70. La inhibición de la señal rápida de Ca2+, mediante ryanodina, no afecta la inducción de Hsp70. La participación de la señal lenta de Ca2+ en la regulación de la expresión de las proteínas Hsp70 y Hmox-1 fue confirmada mediante inmunofluorescencia.

Determinamos que PKC está involucrada en la vía de señalización que induce un aumento en los niveles de mRNA de Hsp70. La despolarización de miotubos en presencia de Go6976, inhibidor de las isoformas de PKC dependientes de Ca2+, inhibe completamente la inducción del mRNA de Hsp70.

Nuestros resultados indican que la señal lenta de Ca2+, inducida por despolarización, tiene un papel importante en la activación de vías que acoplan la excitación a la transcripción de genes específicos. Estos hallazgos nos permiten proponer un modelo acerca del mecanismo involucrado en la regulación de la expresión de Hsp70 y Hmox-1 en células musculares sometidas a despolarización. El receptor de dihidropiridina detectaría el cambio de voltaje en la membrana plasmática activando la fosfolipasa C, que mediante hidrolisis de PIP2 produce IP3 y DAG. El IP3 difundiría al citosol favoreciendo la generación de oscilaciones de Ca2+, que activarían a PKC. PKC a su vez fosforilaria al factor transcripcional HSF1, promoviendo su translocación al núcleo y favoreciendo su interacción con secuencias regulatorias HSE, presentes en las regiones promotoras de los genes Hsp70 y Hmox-1