Insulina atenúa la respuesta a estrés de retículo endoplásmico en cultivos primarios de cardiomiocitos de ratas noenatas

Abstract

Diversas condiciones pueden producir estrés en el retículo endoplásmico, tales como la acción de compuestos, como la tapsigargina (TG) y la tunicamicina (TU) o distintas situaciones patológicas como la hipoxia, daño oxidativo o reductor, infecciones virales e hipoglicemia. Todas ellas generan una acumulación de proteínas mal plegadas en el retículo endoplásmico (RE), que conduce a la activación de una respuesta celular al estrés altamente conservada, evolutivamente conocida como respuesta a proteínas mal plegadas (UPR), la cual puede ser adaptativa, de alarma o muerte dependiendo de la intensidad y cronicidad del estímulo. La respuesta adaptativa está diseñada especialmente para restablecer la homeostasis de RE y su normal funcionamiento por medio de la inducción de genes que codifican a chaperonas, a la vía de degradación de proteínas asociada al RE (ERAD) y la degradación proteoasomal de proteínas, así como también a proteínas que aumentan la capacidad plegadora del RE. Si estas respuestas adaptativas no logran recobrar el equilibrio en el RE, se activa el programa de muerte celular de tipo apoptótico, necrótico o autofágico. Las respuestas adaptativas mencionadas operan principalmente por medio de tres vías transduccionales: IRE1, PERK y ATF6, siendo las vías IRE1 y ATF6 las involucradas en las etapas iniciales de la UPR, para restablecer la homeostasis del RE. Sin embargo al mantenerse el estímulo de estrés las tres vías se activan en conjunto para inducir genes de muerte celular como lo es GADD153/CHOP. La insulina participa en la regulación de diversos procesos celulares, entre los que se encuentran el metabolismo de la glucosa en el tejido muscular y adiposo, el de los ácidos grasos en el hígado y células grasas. Estas acciones están mediadas por medio de la activación de su receptor de membrana, el receptor de insulina (IR), el El modelo experimental utilizado fue cultivo primario de cardiomiocitos de ratas neonatas expuestos a dos tipos de estresores, TG y TU, por 24 hrs., e insulina por 15 minutos y 24 hrs. Los resultados obtenidos mostraron que, tanto TG como TU, indujeron estrés de RE en los cardiomiocitos y que activaron el programa de muerte celular de manera dosis-dependiente, esto determinado por la expresión de la proteína GADD153/CHOP. Sin embargo no se observaron cambios en los niveles de la chaperona Grp78/BIP. La inducción de estrés de RE afectó la viabilidad celular de manera dependiente de la concentración, esto determinado por los ensayos de exclusión de yoduro de propidio (IP) y azul de tripán. Además se observó que la muerte celular posee un componente importante de apoptosis. La insulina por sí sola no indujo estrés de RE en los cardiomiocitos, sin embargo disminuyó la expresión de GADD153/CHOP de los cardiomiocitos estimulados con TG y TU. Este efecto es parcial ya que la insulina no recuperó los niveles basales de GADD153/CHOP. La inducción del estrés de RE con TU o TG en los cardiomiocitos afectó la vía transduccional de la insulina, disminuyendo la activación del receptor de insulina y de PKB/Akt, sin afectar los niveles totales de Akt. Finalmente, los resultados permiten concluir que la insulina es un regulador negativo del estrés de RE en cardiomiocitos inducida por TG y TU

Conditions like thapsigargin (TG) and tunicamycin (TU), hypoxia, reductive and oxidative damage, viral infections and hypoglycemia may produce endoplasmic reticulum stress, leading to an accumulation of misfolded proteins in the ER, and the subsequent activation of a cell stress response knows as UPR. This response can leads to cell adaptation, alarm or cell death. The adaptive response is especially designed to reestablish ER homeostasis by the induction of genes that encode chaperones, the ERAD pathway and the proteoasomal proteins degradation, as well as proteins increasing the folding capacity of the ER. However, depending of the strength or exposure time, the cell death program can be activated leading to that apoptosis, necrosis and autophagy. The adaptive response above described, can signal three independent transductional pathways: IRE1, PERK and ATF6, being IRE1 and ATF6 pathway involved in the early stages of UPR, to reestablish ER homeostasis. However a chronic stress activates cell death signaling pathway, inducing genes like GADD153/CHOP. Insulin participates in different cell processes including the regulation of glucose metabolism in muscle and adipose tissue, fatty acids metabolism in the liver and adipocytes. These actions are mediated by the activation of its membrane receptor, insulin receptor (IR), wich has an intrinsic tyrosine kinase activity and allows the activation of the following signaling cascades PI3K/PKB/Akt and MAPK/ERK. Severeal evidences have shown that TG and TU induce ER stress. However the research made on the insulin activity in the regulation of the ER stress are only in neurons, in which the inhibition of PKB/Akt is capable of induce the GADD153/CHOP expression, but the mechanism involved in this process is not fully understood. Our working hypothesis state that “Insulin attenuates the endoplasmic reticulum stress in cultured cardiomyocytes”. The experimental model was primary cultures of neonatal rat cardiomyocytes exposed to the stressors, TG and TU, for 24 h and insulin for 15 minutes and 24 h. Our results showed that both, TG and TU, induced ER stress in cardiomyocytes activating the cell death program in concentration-dependent manner. This event was characterized by the expression of GADD153/CHOP. However any effect was observed in Grp78/BIP levels. ER stress induction affected the cell viability in concentration-dependent manner, was assessed by IP and tripán blue exclusion tests. We also observed that apoptosis was the type of cell death activated in our model of ER stress. Insulin itself did not induce ER strees in cultured cardiomyocytes, however decreased GADD153/CHOP expression triggered by TG and TU. This effect is partial because the insulin did not recover GADD153/CHOP basal levels. ER stress induction in cultured cardiomyocytes affected insulin signaling pathway characterized by decreased insulin receptor activation and phosphorylated PKB/Akt levels without any effect in total PKB/Akt levels. This effect was seen both with TG and TU. In summary, these results suggest that insulin receptor signaling pathway is negatively regulated by ER stressors in cultured cardiomyocytes