Participación de la vía GSK3-[beta]/NFAT en la hipertrofia inducida por testosterona del cardiomiocito de rata neonata

Abstract

El uso de elevadas dosis de testosterona produce hipertrofia cardiaca, sin embargo los mecanismos celulares no son completamente entendidos. La proteína quinasa GSK3-β (glycogen synthase kinase 3-β) es una quinasa que regula una amplia gama de procesos celulares como la síntesis proteica y actividad de factores transcripcionales, siendo el factor nuclear de células T activadas, NFAT, uno de los más importantes. La GSK3-β ha sido descrita como el principal regulador anti-hipertrófico celular. En este trabajo se estudió si los efectos hipertróficos de la testosterona son mediados, en parte, por la actividad de la vía de transducción de señales GSK3-β/NFAT en cultivo primario de cardiomiocitos de rata neonata. Los resultados muestran que dosis de testosterona que provocan la hipertrofia del cardiomiocito (100 nM) inducen el aumento la fosforilación de GSK3-β, determinado mediante western blot. GSK3-β puede ser fosforilada a través de las vías de señalización intracelulares PI3K/Akt y ERK1/2. En nuestro laboratorio hemos descrito que la testosterona activa ambas vías. Para evaluar si estas quinasas modulan la actividad de GSK3-β se utilizaron inhibidores específicos para ERK1/2 (PD98059), PI3K (LY294002) y Akt (Akt-inhibitor-VIII). La inhibición de la PI3K o de Akt bloqueó la fosforilación de GSK3-β inducida por testosterona, mientras que la inhibición de ERK1/2 no tuvo efectos significativos, lo que sugiere que la vía PI3K/Akt está involucrada en la inhibición de la GSK3-β. El mecanismo de acción de la testosterona involucra la unión de la hormona al receptor intracelular para andrógenos (AR). Para evaluar la contribución del AR en la inhibición de la GSK3-β, los cardiomiocitos fueron pre-incubados con ciproterona, un inhibidor del AR. La inhibición del AR no provocó cambios en el aumento de la fosforilación de la GSK3-β, lo que sugiere que el AR no participa en la inhibición de la GSK3-β inducida por testosterona. Para determinar los efectos de la testosterona sobre los principales efectores río abajo de la GSK3-β se evaluó tanto el cambio en el estado de fosforilación del eIF2Bε y el cambio en la actividad de NFAT. La estimulación de los cardiomiocitos con la hormona disminuyó la fosforilación de eIF2Bε, lo que se asocia al aumento de su actividad traductora y aumento de la síntesis proteica. Además, utilizando el inhibidor específico de GSK3-β, 1-Azakenpaulona (1-Azk), se indujo la desfosforilación de eIF2Bε, lo que sugiere que la inhibición de GSK3-β modula la activación del factor eIF2Bε inducida por testosterona. Por otra parte, la testosterona aumento la actividad transcripcional de NFAT, medida como actividad luciferasa. Al estimular con testosterona cardiomiocitos tratados con diferentes dosis de 1-Azk se observa un efecto aditivo sobre la activación de NFAT-luc, lo que sugiere una relación entre la inhibición de la GSK3-β y el incremento de la actividad de NFAT inducida por testosterona. La testosterona aumentó el tamaño celular y la expresión de la cadena pesada de la β-miosina (β-MHC) y la α-actina esquelética (SKA), considerados como parámetros hipertróficos. El tratamiento con el inhibidor de NFAT, ciclosporina A (CsA, 1 μM), evitó el aumento en del área célula inducido por testosterona. Además, el bloqueo del receptor para IP3 inhibió el aumento de los marcadores de hipertrofia β-MHC y SKA, lo que en conjunto sugiere que la vía Cn/NFAT participaría en la hipertrofia de la célula cardiaca inducida por testosterona. Por otra parte, el uso de 1-Azk por sí sólo incrementó ambos parámetros hipertróficos, lo que sugiere que la inhibición de la GSK3-β participaría en la hipertrofia del cardiomiocito. El tratamiento en conjunto con testosterona y 1-Azk no incremento los efectos hipertróficos de la hormona, lo que se podría deber a que la célula cardiaca en cultivo primario crece hasta un límite definido. La evidencia experimental de este trabajo sugiere que la testosterona induce la inhibición de GSK3-β a través de la vía PI3K/Akt, lo que se traduce en un aumento de la actividad de NFAT y de eIF2Bε. Además, la inhibición de NFAT bloquea la hipertrofia inducida por testosterona. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que la vía GSK3-β/NFAT podría participar en la hipertrofia del cardiomiocito inducida por la testosterona

Elevated doses of testosterone produce cardiac hypertrophy. However, the cellular mechanisms are not fully understood. The GSK3-β (glycogen synthase kinase 3-β) is a protein kinase that regulates several cellular processes like protein synthesis and transcription factors activity. Moreover, this kinase has been described as an anti-hypertrophic regulator. In this study we examined whether the hypertrophic effects of testosterone are mediated, in part, by GSK3-β in primary cultures of neonatal rat cardiomyocytes. The results from this study show that hypertrophic testosterone concentrations (100 nM) increased GSK3-β phosphorylation. GSK3-β can be phosphorylated by upstream signaling pathways as PI3K/Akt and ERK1/2. Previously, we have described that testosterone activates both signaling pathways. To evaluate the contribution of these kinases on GSK3-β activity specific inhibitors for ERK1/2 (PD98059), PI3K (LY294002) and Akt (Akt-inhibitor-VIII) were used Inhibition of either PI3K or Akt completely blocked the GSK3-β phosphorylation induced by testosterone, while inhibition of ERK1/2 had no effect, suggesting that PI3K/Akt pathway is involved in the inhibition of GSK3-β. Testosterone exerts most effects through the direct binding to specific intracellular androgen receptor (AR). To assess the contribution of AR in the GSK3-β inhibition, cardiomyocytes were prei-ncubated with cyproterone an inhibitor of AR. Inhibition of AR did not modifies testosterone-induced GSK3-β phosphorylation, suggesting that the AR is not involved in this event. To determine the effects of testosterone on the main downstream GSK3-β effectors both eIF2Bε phosphorylation and NFAT activity were determined. The hormone decreased eIF2Bε phosphorylation which is associated with translation activity and protein synthesis increase. Moreover, testosterone increased NFAT transcriptional activity, which is associated with gene expression. The specific inhibitor of GSK3-β, 1-Azakenpaullone (1-Azk), induced both eIF2Bε dephosphorylation and increase in the NFAT activity. In cardiomyocytes treated with 1-Azk, testosterone produced eIF2Bε activation and NFAT over-activation. Testosterone increased cell size and expression of β-MHC and SKA, both hypertrophic parameters. Treatment with the upstream NFAT phosphatase calcineurin (Cn) inhibitor cyclosporin A (CsA, 1 mM) prevented the cell area increase induced by testosterone. Furthermore, the IP3 receptor (IP3R) blockade inhibited the increase of β-MHC and SKA, which together suggest that the IP3R/Cn/NFAT pathway modulates the cardiac cell hypertrophy. Moreover, 1-Azk alone increased both hypertrophic parameters, showing that GSK3-β is involved in cardiomyocyte hypertrophy. The combined treatment of testosterone and 1-Azk did not increase the hypertrophic effects on cardiomyocytes, suggesting that cardiac cell grows until a defined limit. Experimental evidence of this work suggests that testosterone induces the inhibition of GSK3-β through the PI3K/Akt pathway, resulting in an increase in the activity of NFAT and eIF2Bε. Furthermore, inhibition of NFAT blocks testosterone-induced hypertrophy. Taken together, these results suggest that the GSK3-β/NFAT pathway is involved in cardiomyocyte hypertrophy induced by testosterone