Determinación de especies de glutatión por electroforesis capilar en plantas bajo estrés por cobre

Abstract

El objetivo de éste estudio fue optimizar un método por Electroforesis Capilar de Zona para la determinación rápida de glutatión reducido (GSH) y oxidado (GSSG) en la matriz de tejido vegetal de hojas y raíces de plantas de tomate (Lycopersicon esculentum L.). Se compararon dos tratamientos de muestra diferentes para el aislamiento de los analitos de la matriz vegetal, se determinó los niveles de GSH y GSSG en plantas sometidas a estrés por cobre en dos periodos de tiempo (48 horas y 28 días) y se evaluó el efecto de cobre sobre la biomasa y los niveles de macronutrientes presentes en la planta.

De los resultados obtenidos se concluye que: La optimización de los parámetros instrumentales, tales como largo de capilar, voltaje aplicado y polaridad de la fuente de poder, así como la optimización de los parámetros relacionados con el electrolito de corrida, tales como composición, concentración, pH y fuerza iónica permiten la separación de ambos analitos en un tiempo inferior a los tres minutos. Las condiciones óptimas fueron: polaridad de la fuente positiva, capilar de 40 cm de largo, voltaje de 20 kV, electrolito borato 300 mM, pH 7,6 y 30 segundos de inyección hidrostática de la muestra.

El método optimizado para la matriz vegetal presenta una muy buena correlación entre área bajo la curva y concentración de GSH y GSSG, con coeficientes de correlación de 0,9995 y 0,9994, respectivamente. Los límites de detección fueron 2,75 y 1,68 µmol/L para GSH y GSSG y la recuperación del analito en el proceso fue de 105 y 87 %, respectivamente.

En la etapa de tratamiento de la muestra, el uso de un método químico (ácido metafosfórico) es más efectivo que el uso de un método físico (copas de ultrafiltración) para el aislamiento de los analitos desde la matriz proteica. Esta efectividad se reflejo en un menor consumo de tiempo, mayor volumen de muestra obtenido y obtención de una matriz mas limpia.

El tratamiento prolongado de las plantas con cobre se manifiesta en síntomas de toxicidad con una drástica disminución de la biomasa de la parte aérea y raíz, en asociación con un descenso de la concentración de potasio en ambos órganos. Este efecto no se observa en plantas tratadas por un periodo corto de tiempo con el metal.

Los niveles de cobre alcanzados en la parte aérea y raíz correlacionan positivamente con la concentración de cobre aplicada en ambos tratamientos, siendo las concentraciones más altas observadas en la raíz El cobre aplicado a la planta modifica los niveles de glutatión reducido y oxidado tanto en el tratamiento crónico como en el agudo. El efecto más notorio se manifestó sobre el glutatión reducido contenido en la raíz. Este péptido decrece su concentración a medida que incrementa la concentración de cobre, siendo este efecto independiente de los cambios morfológicos que presenta la raíz y del lapso de tiempo en que el cobre fue aplicado.

Los cambios producidos en los niveles de glutatión reducido y oxidado constituyen un buen indicador de la respuesta temprana al estrés por metal en plantas desarrolladas, expuestas a cobre por un periodo de tiempo corto (horas)

The purpose of this study was to optimize a zone capillary electrophoresis method for fast determination of reduced glutathione (GSH) and oxidized glutathione(GSSG)in the plant tissue matrix of shoot and root of tomato (Lycopersicon esculentum L) plants. Two different sample treatments were compared in order to isolate analytes from plant matrix, GSH and GSSG levels were determined in plants subjected to copper stress in two time periods (48 hours and 28 days), and assessment was done of the effect of copper on biomass and on macronutrient levels in the plant. From the results, it may be concluded that: Optimization of instrumental parameters such as capillary length, voltage applied, and polarity of the power supply as well as optimization of parameters related to running electrolyte such as composition, concentration, pH, and ionic strength permit the separation of both analytes in less than three minutes. Optimum operating conditions were: positive supply polarity; capillary length, 40 cm; voltage, 20 kV; borate electrolyte, 300 mM; pH, 7.6, and time of hydrostatic sample injection, 30 sec. The optimized method for the plant matrix shows a very good correlation between area under the curve and GSH and GSSH concentration, with correlation coefficients of 0.9995 and 0.9994, respectively. Detection limits were 2.75 and 1.68 μmol/L for GSH and GSSG and analyte recovery in the process was 105 and 87%, respectively. During the sample treatment stage, using a chemical method (metaphosphoric acid) is more effective than a physical method (ultrafiltration cups) to isolate analytes from the protein matrix. This effectiveness was shown by shorter working time, greater sample volume obtained, and a cleaner matrix. Prolonged plant copper treatment becomes evident through toxicity symptoms with a sharp decrease of biomass in shoot and root, associated to a decrease in potassium concentration in both organs. This effect is not observed in plants treated with the metal for a short time. Copper levels reached by the plant in shoot and root correlate positively with the concentration of copper applied in both treatments, the highest concentrations being observed in the root. Copper applied to the plant modifies reduced and oxidized glutathione both in the acute and in the chronic treatment. The effect becomes most notorious on reduced glutathione in the root. This peptide concentration decreases as copper concentration increases, regardless of morphological changes in the root and period of copper application. Changes produced in the levels of reduced and oxidized glutathione constitute a good indicator of an early response to metal stress in developed plants exposed to copper for a short time (hours).