Participación del factor RpoN en la regulación de rfaH de S. Typhi

Abstract

Salmonella enterica serovar Typhi (S. Typhi) es una patógeno exclusivo del ser humano y agente causal de la fiebre tifoidea. Esta enfermedad constituye un problema de salud pública a nivel mundial especialmente en países en vías de desarrollo. Nuestro trabajo se ha enfocado a comprender la regulación de la producción del lipopolisacárido (LPS) y su papel en la virulencia de esta bacteria. El LPS es el componente principal de la envoltura de las bacterias Gram negativas y, por lo tanto, es un importante mediador de las interacciones con el hospedero. Estudios anteriores de nuestro laboratorio han demostrado que la producción del antígeno O (AgO), el componente más externo de la molécula de LPS, varía durante el crecimiento bacteriano, aumentando en las fases exponencial tardía y estacionaria. Esta modulación es mediada por el factor RfaH, que regula positivamente la transcripción del operón wba encargado de la síntesis del AgO. La expresión del gen rfaH también aumenta en la etapa de transición a fase estacionaria y su activación requiere la función del factor sigma alternativo RpoN. En este trabajo se estudió el mecanismo de activación de la transcripción de rfaH mediado por RpoN. Se planteó como hipótesis que el factor sigma de estrés RpoN regula la expresión de rfaH en S. Typhi, mediante la unión directa a la región promotora de rfaH o indirectamente a través de proteínas accesorias. El hallazgo previo de la existencia de dos sitios de inicio de la transcripción con sus respectivos promotores, se confirmó mediante la construcción de vectores reporteros que contienen fusiones transcripcionales de los respectivos promotores P1 o P2 al gen lacZ. Se demostró que el promotor P1 es el responsable de la regulación fase-dependiente de la transcripción de rfaH, en cambio el promotor P2 contribuiría marginalmente a esta regulación. Se estudio la unión de RpoN a una probable secuencia de reconocimiento de este factor sigma en el promotor P1. Para esto se clonó el marco de lectura en el vector pET-21b(+) y se sobreexpresó y purificó la proteína recombinante RpoN-HisTag mediante cromatografía de afinidad a Ni. Se utilizó una fracción altamente purificada de esta proteína en ensayos de retardo en geles (EMSA). Se demostró que RpoN no se une al promotor P1 y por lo tanto no participa directamente en la regulación fase-dependiente de rfaH. La regulación mediada por este factor sigma es dependiente de su activación por proteínas activadoras, denominadas "enhancer binding proteins" (EBP). Para identificar la EBP que participa en la regulación de rfaH, se construyeron mutantes por deleción en 6 genes para las probables EBPs encontradas en el genoma de S. Typhi. De estas mutaciones, sólo aquella en ygaA, factor encargado de la transcripción de genes para detoxificar NO, presentó un efecto significativo sobre la transcripción de la fusión rfaH-lacZ, que consistió en un aumento de la actividad β-galactosidasa durante la fase exponencial temprana. Los resultados de este trabajo indican que la regulación transcripcional fase-dependiente de rfaH es mediada de forma indirecta por RpoN, a través de proteínas accesorias que serían reguladas por este factor sigma para ejercer su efecto sobre el promotor P1.