Desarrollo de ribozimas de horquilla y martillo para disminuir la actividad de la deshidrogenasa aldehídica mitocondrial (ALDH2) de rata

Abstract

Existen genes que, según las variantes que se presentan en la naturaleza,pueden ser permisivos o protectores frente al alcoholismo. El gen ALDH2 eshabitualmente permisivo (alelo ALDH2*1) porque codifica la enzimadeshidrogenasa aldehídica mitocondrial la cual cataliza la oxidación delacetaldehído a acetato en la vía degradativa del etanol. Este gen tiene unsegundo alelo protector, ALDH2*2, que da origen a una enzima inactiva,impidiendo la oxidación del acetaldehído y desencadenando en los individuosportadores un aumento en los niveles plasmáticos de acetaldehído de hasta 20veces sobre lo normal. Estos individuos sienten malestares físicos comomareos, taquicardia y náuseas al consumir alcohol lo que les provoca unaaversión frente al consumo.

Siendo el alelo ALDH2*2 un gen protector frente al alcoholismo, producir una disminución de la actividad enzimática es una buena estrategia terapéutica frente a la enfermedad. Un tratamiento farmacológico habitual para el alcoholismo es generar una aversión al consumo de alcohol con disulfiram. Este fármaco inactiva eficazmente la deshidrogenasa aldehídica mitocondrial (ALDH2), pero es muy tóxico. Una alternativa terapéutica es imitar el efecto del disulfiram silenciando el mRNA de la ALDH2 con ribozimas, RNAs catalíticos pequeños capaces de disminuir la síntesis proteica por ocupación y/o degradación del mRNA.

Se ensayaron ribozimas de horquilla y martillo dirigidas hacia un mismo blanco del mRNA de la ALDH2 en células de hepatoma de rata en cultivo, dado que el hígado es el órgano más importante en la degradación del etanol. Se lipofectaron células H4-II-E-C3 con plasmidios portadores de genes de ribozimas y se midió la actividad de la ALDH2 espectrofotométricamente en extractos celulares. Se usaron ribozimas control para determinar posibles efectos de antisentido.

La ribozima de horquilla (RzCG20), clonada en el vector pAC-CMV y codificada en un gen que posee el promotor del citomegalovirus y la señal de poliadenilación del virus SV40, disminuyó en 42 % (p<0,005) la actividad de la ALDH2 en las células H4-II-E-C3, siendo el 44 % del efecto adjudicable a bloqueo del mRNA. En cambio, la ribozima de horquilla clonada en el vector pAAV-CMV y codificada en un gen cuya señal de poliadenilación es la de la hormona del crecimiento humana, disminuyó en 36 % (p<0,005) la actividad de la ALDH2 en las células en cultivo, siendo el 64 % del efecto adjudicable a bloqueo del mRNA. La ribozima de martillo redujo sólo en 20% la actividad de la ALDH2, efecto dado exclusivamente por bloqueo del mRNA.

Efectuando correcciones con el tiempo de vida media de la enzima se estima que el porcentaje de disminución del 42 % de la actividad de la ALDH2 es de al menos 56% al usar el gen de una ribozima de horquilla anti ALDH2. No se corrigió por el porcentaje de células H4-II-E-C3 transfectadas debido a la imposibilidad de obtener una estimación razonable usando el gen de la eGFP como reportero. Sin embargo, el porcentaje mínimo (56 %) concuerda con que en células 293 derivadas de riñón de embrión humano, cuyo porcentaje de transfección es cercano al 70 %, la ribozima disminuyó en 68 % (p<0,005) la actividad de la ALDH2 únicamente por acción antisentido.

Buscando alcanzar un 100 % de transfección se lipofectaron células H4-II-E-C3 con plasmidios derivados del pCEP4 codificantes de las ribozimas de horquilla y su control. Este vector, que otorga permanencia y segregación divisional, mostró efectos tóxicos sobre las células de manera que no se pudo evaluar el efecto de la ribozima de horquilla en un cultivo celular homogéneo.

Los resultados de este trabajo de tesis muestran que la ribozima de horquilla RzCG20, dirigida a los nucleótidos 1553 a 1569 del mRNA de la ALDH2 de rata, es un buen candidato para experimentos in vivo enfocados hacia el desarrollo de un fármaco génico para el alcoholismo.

Certain genes may be permissive or protective for alcoholism depending on natural variation. The ALDH2 gene is normally permissive (ALDH2*1 allele) because it encodes aldehyde dehydrogenase 2, a mitochondrial enzyme which catalizes the oxidation of acetaldehyde into acetate in the main route of ethanol degradation. This gene has a second allele, ALDH2*2, which generates an inactive enzyme, thus preventing the oxidation of acetaldehyde and triggering an increase in blood acetaldehyde of up to 20 times the normal level. Carriers of ALDH2*2 feel physical discomfort such as dizziness, tachycardia and nausea upon drinking alcohol generating in them an aversion to alcohol. Given that ALDH2*2 protects from alcoholism, diminishing the activity of the enzyme is an excellent strategy to treat the disease. A routine and effective pharmacological treatment for alcoholism is the use of disulfiram to achieve aversion to alcohol. This drug inactivates mitochondrial aldehyde dehydrogenase but is very toxic. A therapeutic alternative is to imitate the effect of disulfiram by silencing the ALDH2 mRNA with ribozymes, small catalytic RNAs capable of diminishing protein synthesis by occupation and/or degradation of the mRNA. Hairpin and hammerhead ribozymes directed to the same target on the Aldh2 mRNA were tested in rat hepatoma cells in culture given that the liver is the main site of alcohol degradation. H4-II-E-C3 cells were lipofected with plasmids carrying the ribozyme genes and ALDH2 activity was measured spectrophotometrically in cell extracts. Control ribozymes were used to assess possible antisense effects. The hairpin ribozyme (RzCG20), cloned in the pAC-CMV vector and coded in a gene having a cytomegalovirus promoter and an SV40 polyadenylation signal, diminished the ALDH2 activity of H4-II-E-C3 cells by 42 % (p<0.005) of which 44 % may be ascribed to blockade of the mRNA. In contrast, the same hairpin ribozyme, but cloned in the pAAV-CMV plasmid and coded in a gene having the polyadenylation signal of the gene for the human growth hormone, diminished the ALDH2 activity in cells in culture by 36 % (p<0.005), 64 % of which is accounted for by blockade of the mRNA. The hammerhead ribozyme provided only a 20 % reduction in the ALDH2 activity being afforded exclusively by blockade of the mRNA. The 42 % reduction in ALDH2 activity achieved with the hairpin ribozyme gene may be considered to be 56 % when the half life of the enzyme is taken into account. Due to the impossibility of obtaining a reasonable estimate of the efficiency of transfection with an eGFP reporter gene an additional correction factor could not be applied. However, the minimum 56 % reduction in ALDH2 activity obtained in H4-II-E-C3 cells is in agreement with the 68 % (p<0.005) achieved in 293 cells derived from embryonic human kidney in which the efficiency of transfection is around 70%; nevertheless, the ribozyme action was entirely due to an antisense effect. Aiming to obtain a fully (100 %) transfected culture, H4-II-E-C3 cells were lipofected with plasmids derived from pCEP4 encoding the active and control hairpin ribozymes. This vector, which allows replication and segregation coupled to cell division, had toxic effects in these cells and it was not possible to assess the effect of the hairpin ribozyme in a homogeneous population of cells by this strategy, conceived as an alternative to viral delivery. The results of this thesis work show that the hairpin ribozyme RzCG20, targeted to nucleotides 1553 to 1569 of the rat ALDH2 mRNA, is a good candidate for in vivo experiments geared towards developing genetic drugs for alcoholism.