Desarrollo de ribozimas de horquilla y martillo para disminuir la actividad de la deshidrogenasa aldehídica mitocondrial (ALDH2) de rata

Abstract

Existen genes que, según las variantes que se presentan en la naturaleza,pueden ser permisivos o protectores frente al alcoholismo. El gen ALDH2 eshabitualmente permisivo (alelo ALDH2*1) porque codifica la enzimadeshidrogenasa aldehídica mitocondrial la cual cataliza la oxidación delacetaldehído a acetato en la vía degradativa del etanol. Este gen tiene unsegundo alelo protector, ALDH2*2, que da origen a una enzima inactiva,impidiendo la oxidación del acetaldehído y desencadenando en los individuosportadores un aumento en los niveles plasmáticos de acetaldehído de hasta 20veces sobre lo normal. Estos individuos sienten malestares físicos comomareos, taquicardia y náuseas al consumir alcohol lo que les provoca unaaversión frente al consumo.

Siendo el alelo ALDH2*2 un gen protector frente al alcoholismo, producir una disminución de la actividad enzimática es una buena estrategia terapéutica frente a la enfermedad. Un tratamiento farmacológico habitual para el alcoholismo es generar una aversión al consumo de alcohol con disulfiram. Este fármaco inactiva eficazmente la deshidrogenasa aldehídica mitocondrial (ALDH2), pero es muy tóxico. Una alternativa terapéutica es imitar el efecto del disulfiram silenciando el mRNA de la ALDH2 con ribozimas, RNAs catalíticos pequeños capaces de disminuir la síntesis proteica por ocupación y/o degradación del mRNA.

Se ensayaron ribozimas de horquilla y martillo dirigidas hacia un mismo blanco del mRNA de la ALDH2 en células de hepatoma de rata en cultivo, dado que el hígado es el órgano más importante en la degradación del etanol. Se lipofectaron células H4-II-E-C3 con plasmidios portadores de genes de ribozimas y se midió la actividad de la ALDH2 espectrofotométricamente en extractos celulares. Se usaron ribozimas control para determinar posibles efectos de antisentido.

La ribozima de horquilla (RzCG20), clonada en el vector pAC-CMV y codificada en un gen que posee el promotor del citomegalovirus y la señal de poliadenilación del virus SV40, disminuyó en 42 % (p<0,005) la actividad de la ALDH2 en las células H4-II-E-C3, siendo el 44 % del efecto adjudicable a bloqueo del mRNA. En cambio, la ribozima de horquilla clonada en el vector pAAV-CMV y codificada en un gen cuya señal de poliadenilación es la de la hormona del crecimiento humana, disminuyó en 36 % (p<0,005) la actividad de la ALDH2 en las células en cultivo, siendo el 64 % del efecto adjudicable a bloqueo del mRNA. La ribozima de martillo redujo sólo en 20% la actividad de la ALDH2, efecto dado exclusivamente por bloqueo del mRNA.

Efectuando correcciones con el tiempo de vida media de la enzima se estima que el porcentaje de disminución del 42 % de la actividad de la ALDH2 es de al menos 56% al usar el gen de una ribozima de horquilla anti ALDH2. No se corrigió por el porcentaje de células H4-II-E-C3 transfectadas debido a la imposibilidad de obtener una estimación razonable usando el gen de la eGFP como reportero. Sin embargo, el porcentaje mínimo (56 %) concuerda con que en células 293 derivadas de riñón de embrión humano, cuyo porcentaje de transfección es cercano al 70 %, la ribozima disminuyó en 68 % (p<0,005) la actividad de la ALDH2 únicamente por acción antisentido.

Buscando alcanzar un 100 % de transfección se lipofectaron células H4-II-E-C3 con plasmidios derivados del pCEP4 codificantes de las ribozimas de horquilla y su control. Este vector, que otorga permanencia y segregación divisional, mostró efectos tóxicos sobre las células de manera que no se pudo evaluar el efecto de la ribozima de horquilla en un cultivo celular homogéneo.

Los resultados de este trabajo de tesis muestran que la ribozima de horquilla RzCG20, dirigida a los nucleótidos 1553 a 1569 del mRNA de la ALDH2 de rata, es un buen candidato para experimentos in vivo enfocados hacia el desarrollo de un fármaco génico para el alcoholismo.