Detección de daño al ADN inducido por peroxinitrito mediante biosensores electroquímicos

Abstract

En esta memoria se informa sobre el estudio de la adsorción y electrooxidación de ADN sobre un electrodo de pasta de carbono (CPE) y su aplicación a la evaluación de daño al ADN por peroxinitrito, un agente oxidante biológico. Se trabajó con moléculas de ADN de una (ssADN) y doble hebra (dsADN). La modificación del electrodo se realizó a través de la adsorción directa de las moléculas sobre CPE, aplicando un potencial de 0.5 V por un tiempo predeterminado, en buffer acetato a pH 5.0. Mediante voltamperometría de pulso diferencial se obtuvo una señal analítica a 1.0 V, correspondiente a la oxidación de los residuos de guanina presentes en las moléculas. La reproducibilidad presenta valores de coeficientes de variación cercanos al 10% para los dos tipos de ADN. Se observó una respuesta lineal con el tiempo de acumulación y con la concentración del polinucleótido utilizado, en ambos casos también se evidenció una saturación de la superficie electródica. Los estudios de interacción de ADN con peroxinitrito (ONOO-) fueron realizados en buffer fosfato 0.1 M pH 7.4 a 37º C, medio al que se transfiere el electrodo con el ADN previamente inmovilizado. Bajo estas condiciones el electrodo modificado presenta una alta estabilidad, ya que los controles realizados muestran que el ADN no se desorbe incluso hasta después de 20 minutos de incubación en fosfato. En presencia de diferentes concentraciones de ONOO- (100 – 1000 μM), se observó una disminución en la respuesta electroquímica del ADN, en cerca del 30 % en el caso de ADN de doble hebra. A concentraciones altas de peroxinitrito (> 1000 μM) se observa en ambos casos (dsADN y ssADN) un aumento de la respuesta electroquímica, lo que es atribuido a reordenamientos y/o rompimientos en las moléculas, lo que permite que más residuos de guanina queden expuestos a la oxidación electroquímica sobre el electrodo. Por ultimo a concentraciones aun mayores la respuesta electroquímica cae hasta un 50 % del valor de referencia. En conclusión, es posible utilizar electrodos de pasta de carbono modificados con moléculas de ADN para la detección de daño sobre el ADN debido a la alta sensibilidad, reproducibilidad y estabilidad que éstos presentan.

In this thesis the adsorption and electrooxidation of DNA molecules on carbon paste electrodes (CPE) and its application to DNA damage by peroxynitrite is informed. Double (dsDNA) and single (ssDNA) stranded DNA were used. The modified electrode was obtained through direct adsorption of the molecules on the CPE applying a potential of 0.5 V for different times in acetate buffer pH 5.0. Using differential pulse voltammetry a well-defined signal around 1.0 V was obtained, which correspond to the oxidation of the guanine residues present in the molecule. The reproducibility of the method shows a RSD lower than 10 % for both DNAs. A linear response was obtained changing both the accumulation time and the concentration of the polynucleotide. Also in both cases a saturation of the response was observed at high times or concentrations. The interaction studies between DNA and peroxynitrite (ONOO-) were conducted in phosphate buffer pH 7.4 at 37 ºC. In this medium the biosensor is transferred to permit the interaction with the previously dissolved ONOO-. Under this condition the modified electrode shows a great stability since the experimental control indicates that the DNA was not desorbed even at 20 minutes of incubation without peroxynitrite. When the peroxynitrite concentration was changed (100 - 1000μM) a decrease in the electrode response was observed until 30 % in the case of dsDNA. At higher concentrations of peroxynitrite (> 1000 μM) in both cases (dsADN and ssADN) an increase in the electrochemical response occurred, indicating that a rearrangement or a strand break of the DNA would be taken place and more guanines are exposed to be oxidated. Finally at higher ONOO- concentrations the electrochemical response decay strongly until 50 % of the starting signal when 2 mM of ONOO- is used. In conclusion DNA modified carbon paste electrodes are appropriate for the DNA damage studies due to its good reproducibility, sensibility and stability.