Estudio químico y farmacológico de un extracto activo de buddleja globosa hope, buddlejaceae, matico y diseño de la metodología analítica

Abstract

La evaluación farmacológica y estudios químicos de Buddleja globosa, matico, realizados anteriormente en nuestro laboratorio y la importancia terapéutica en el tratamiento de afecciones a la piel que un extracto alcohólico fraccionado ha mostrado en estudios clínicos preliminares, nos impulsaron a desarrollar un estudio químico y farmacológico detallado que permita la estandarización de este extracto, además de identificar aquellos compuestos que posean la responsabilidad farmacológica de sus actividades antiinflamatoria y analgésica. El análisis cualitativo de los extractos alcohólicos seriados de hojas recolectadas en verano y otoño (EMAT-1, ETMATverano y ETMATotoño) por cromatografía en capa fina y HPLC permitió evidenciar la presencia de cuatro compuestos mayoritarios, siendo los más abundantes verbascósido (feniletanoide) y el 7-O-glucósido de luteolina (flavona), seguido por otros dos que se denominaron MAT-3 y MAT-5. La actividad analgésica de los dos compuestos mayoritarios fue evaluada en ratones mediante los ensayos del latigazo de la cola (vía tópica y oral) y de las contorsiones abdominales inducidas por ácido acético como métodos térmicos y químicos de dolor agudo a concentraciones y dosis equimolares al EC25 ó ED25 del ibuprofeno y del naproxeno sódico, utilizados como fármacos de referencia. El verbascósido mostró un 30,25 ± 7,29% y un 27,47 ± 3,81% de actividad tópica y oral, mientras que el 7-O-glucósido de luteolina presentó 24,46 ± 3,61% y un 28,24 ± 4,99% respectivamente en el ensayo del latigazo de la cola, en su mayoría levemente superiores al ibuprofeno y al naproxeno sódico. En el ensayo de las contorsiones abdominales el efecto del verbascósido fue muy superior al de la flavona (67,6 ± 2,6% y un 27,0 ± 9,1% respectivamente). Los resultados obtenidos permitirían atribuirle, en gran parte, a estos metabolitos la propiedad analgésica de los diferentes extractos alcohólicos. Ensayos preliminares para evaluar la actividad analgésica tópica (latigazo de la cola) de dos formulaciones dermatológicas que se someterán a estudios clínicos (gel y crema conteniendo un 1% de EMAT-1) mostraron similar efecto analgésico: 47,93 ± 4,23% y 45,87 ± 6,07% respectivamente. Para la estandarización química del extracto fue necesario desarrollar una metodología analítica que permita la cuantificación de sus metabolitos activos. Se logró establecer una metodología analítica por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) obteniendo el perfil cromatográfico bajo las condiciones definidas. Se seleccionaron los patrones primarios ácido cafeico y rutina para expresar feniletanoides y flavonoides, respectivamente. Éstos permitieron la cuantificación de los principales compuestos presentes en el extracto, mediante el establecimiento de curvas de calibración. En los extractos se encontró respectivamente para verbascósido y 7-O-glucósido de luteolina: 11,43 ± 0,34% y 1,20 ± 0,03% para ETMATotoño, 24,50 ± 0,14% y 1,23 ± 0,01% para ETMATverano, 25,45 ± 0,32% y 1,26 ± 0,04% para EMAT-1 y 18,12 ± 0,10 y 1,23 ± 0,02% para un extracto metanólico global (EMG). Con estos resultados se pudo apreciar que existe variación estacional en la composición de los extractos de los feniletanoides sin variar la cantidad de flavonoides, que no existe diferencia al usar metanol o etanol en la elaboración de los extractos y la importancia de obtener extractos alcohólicos seriados al ver la disminución de la concentración de los componentes activos en el EMG, el cual no corresponde a un extracto seriado. Analizando los métodos espectrofotométricos actualmente empleados para el control de calidad de extractos de B. globosa, se comparó el método de Glories (adaptado en trabajos previos) y el de Folin-Ciocalteu con el método HPLC. Esta comparación confirmó las ventajas que posee la metodología HPLC sobre los métodos espectrofotométricos, puesto que el método de Glories presenta una baja exactitud en la expresión de los resultados debido a la interferencia que los feniletanoides generan sobre los flavonoides y que el método de Folin-Ciocalteu sólo entrega la concentración de fenoles totales hidrosolubles sin valorar particularmente a aquellos metabolitos activos de interés farmacológico.

The pharmacological evaluation and chemical studies previously developed in our laboratory for Buddleja globosa, matico added to the therapeutic relevance in the treatment of skin ailments that one fractioned alcoholic extract has demonstrated in preliminary clinical studies stimulated us to develop a detailed chemical and pharmacological study which leads to the standardization of this extract and at the same time the identification of those compounds which own the pharmacological responsibility of its antiinflamatory and analgesic activities. The qualitative analysis of the serial alcoholic extracts of the leaves collected in summer and autumn (EMAT-1, ETMATsummer and ETMATautumn) through thin layer chromatography and HPLC allowed us to evidence the presence of four mayor compounds, being the most abundant verbascoside (phenylethanoid) and the luteolin 7-O-glycoside (flavone), followed by two others which were denominated MAT-3 and MAT-5. The analgesic activity of the two mayor compounds was evaluated in mice through the tail flick test (topic and per os) and the writhing test (induced by acetic acid) as thermal and chemical methods of acute pain, in concentrations and equimolar doses to the EC25 or ED25 of ibuprofen and naproxen sodium used as reference drugs. Verbascoside showed a 30.25 ± 7.29% and a 27.47 ± 3.81% of topical and per os activity, meanwhile luteolin 7-O-glycoside showed a 24.46 ± 3.61% and a 28.24 ± 4.99% respectively in the tail flick test, slightly grater than ibuprofen. In the writhing test the effect of verbascoside was greatly higher than that of the flavone (67.6 ± 2.6% and 27.0 ± 9.1% respectively). The obtained results would permit to attribute, in big part, to these metabolites the analgesic property found in the different alcoholic extracts. Preliminary assays for the topic analgesic activity evaluation (tail flick test) of two dermatological formulations (gel and cream 1% of EMAT-1) which will undergo clinical trial, showed similar analgesic effect: 47.93 ± 4.23% and 45.87 ± 6.97% respectively. For the chemical standardization of the extract, was necessary to develop a method which will allow quantifying its active metabolites. The establishment of a high performance liquid chromatography (HPLC) method was accomplished; the chromatographic profile under the already defined conditions was set. The primary standards caffeic acid and rutin were chosen to express phenylethanoids and flavonoids respectively. These permitted the quantification of the main compounds present in the extract by means of the setting of the respective calibration curves. In the extracts was found respectively for verbascoside and luteolin 7-O-glycoside: 11.43 ± 0.34% and 1.20 ± 0.03% for ETMATotoño, 24.50 ± 0.14% and 1.23 ± 0.01% for ETMATverano, 25.45 ± 0.32% and 1.26 ± 0.04% for EMAT-1 and 18.12 ± 0.10 and 1.23 ± 0.02% for a global methanolic extract (EMG). With these results was possible to observe that seasonal variation exists in the composition of extracts of the phenylethanoids with no variation in the amount of flavonoids, there is no difference between using methanol or ethanol in the elaboration of the extracts and the importance of producing serial alcoholic extract given the fact that the concentration of the active compunds decrease in the EMG, which was not a serial extract. Analyzing the existent spectrophotometric methods, presently used for the quality control of B. globosa extracts, the Glories method (adapted in previous works) and the Folin-Ciocalteu method with the HPLC method. This comparison confirmed the advantages that the HPLC methodology owns over the spectrophotometric methods, since the Glories method holds low accuracy in the expression of results because the interference phenylethanoids cause over flavonoids and that the Folin-Ciocalteu methods only gives the concentration of total water soluble phenols instead of particularly quantifying those active metabolites of pharmacological interest.