Sistemas de captación y transporte de hierro en Acidithiobacillus ferrooxidans : efecto de la biodisponibilidad de hierro sobre la expresión génica

Abstract

El hierro es a la vez un micronutriente esencial y un potencial agente de daño oxidativo. Como para las bacterias este elemento es imprescindible, es necesaria una estricta regulación de su concentración intracelular. La homeostasis del hierro se logra mediante la regulación de su adquisición, almacenamiento y utilización. Acidithiobacillus ferrooxidans es una bacteria acidófila que vive en un medio cuya biodisponibilidad de hierro supera con creces a la tolerada por bacterias neutrófilas. Es por lo tanto muy interesante estudiar cómo esta bacteria logra mantener la homeostasis del hierro en estas condiciones. El objetivo de esta tesis fue estudiar los sistemas de captación y transporte de hierro en A. ferrooxidans, centrando el análisis principalmente en los genes predichos para receptores de sideróforos (omr). Al analizar su ubicación y contexto genómico, se observó que estos genes forman parte de clusters bien definidos cuya organización génica es singular, ya que además de estar asociados a genes relacionados con el transporte de hierro, varios de ellos tienen genes vecinos con funciones predichas no relacionadas. Mediante un ensayo de co-transcripción demostramos que uno de los clusters génicos es un operón. El análisis de la expresión a nivel de mRNA de los omrs se realizó en bacterias crecidas en medios de cultivo con diferente sustrato energético y concentración de hierro soluble (hierro, azufre, tiosulfato y calcopirita) y diferente pH (azufre a pH 2,5-3,5-4,5). Al comparar cultivos en hierro a pH 1,6 con cultivos en azufre a pH 3,5 la mayoría de los genes omr con igual especificidad predicha para sideróforo mostraron perfiles transcripcionales similares. Por otro lado, el análisis de expresión en medios de azufre con pHs diferentes se abordó considerando el punto isoeléctrico predicho para los OMR, pero no se encontró una correlación clara entre expresión, pH del medio y este parámetro. Adicionalmente se evaluó la expresión génica de dos transportadores de Fe+2 (feoB y mntH), encontrándose resultados similares a los descritos en otras bacterias, esto es una mayor expresión cuando la concentración de hierro del medio de crecimiento es baja. Por otra parte, dada la presencia de cajas Fur predichas en varios de los clusters génicos de transporte de hierro, y la gran cantidad de genes relacionados con el metabolismo de fosfato que estos presentan, se incluyeron en el análisis los genes de los reguladores Fur y PhoB. Ambos genes mostraron un comportamiento opuesto a lo esperado: el gen fur mostró un perfil transcripcional inverso a lo que se observa a nivel de proteína; y phoB, teniendo río arriba una caja Fur validada in vitro, presentó un comportamiento contrario al de un gen reprimido por Fur. Para la validación in vivo de los sitios de unión del regulador Fur, implementamos en el laboratorio el ensayo de chIP-on-chip. Se logró implementar con éxito la primera etapa de este ensayo, pero deberán adicionarse en un futuro protocolos de amplificación de la señal para poder alcanzar los resultados esperados.

Iron is both an essential micronutrient and a potential agent of oxidative damage, and strict regulation of its intracellular concentration is required. This regulation is achieved by homeostatic mechanisms that balance iron acquisition, storage and utilization. Acidithiobacillus ferrooxidans is an acidophilic bacterium that thrives in environments with very high levels of bioavailable iron greatly surpassing the concentration tolerated by neutrophilic bacteria. Therefore, it is very important to study iron homeostasis in A. ferrooxidans. This thesis aims to study the iron acquisition systems of A. ferrooxidans, focusing the analysis on genes predicted to encode siderophore receptors (omr) and Fe2+ transporters. An analysis of the genomic context and location of the omr genes revealed that they constitute defined clusters with genetic organizations not encountered in other microorganisms. In addition to their association with other genes related to iron transport, some of them have neighboring genes with non iron-related predicted functions. By means of a co-transcription assay we demonstrated that one of these clusters is an operon. Gene expression analysis for the predicted omrs was performed on cell cultures grown, to the logarithmic phase, in media with different energetic substrates and soluble iron concentrations (iron, sulfur, thiosulfate and chalcopyrite) and with different pHs (sulfur at pH 2.5-3.5-4.5). When comparing results derived from iron cultures at pH 1.6 to sulfur cultures at pH 3.5, most omrs sharing similarly predicted siderophore affinities showed similar transcriptional profiles. An earlier observation had demonstrated that the OMR exhibited a range of predicted isoelectric points from pI 6.7 to pI 9.2 and we evaluated the possible relationship between these predicted pIs and the expression of the corresponding genes in cells grown in sulfur medium at different pHs. However, no clear correlation could be established. In addition, the genetic expression of the two Fe+2 transporters feoB and mntH was evaluated. Results demonstrate that these genes exhibit higher expression under iron restricted conditions, as has been observed in other bacterial systems. The presence of potential Fur boxes and genes related to phosphate metabolism in several of the predicted omr clusters prompted an evaluation of the expression of genes encoding the transcriptional regulators Fur and PhoB. Both fur and phoB showed an unexpected behavior: fur was induced in iron while the Fur protein levels have been shown previously to decrease in the presence of high iron concentrations; and phoB, with an upstream experimentally validated Fur box, was not repressed in iron as expected for a typical Fur target. Also, the first experimental stages of a chIP-on-chip strategy for the whole genome mapping of Fur binding sites in vivo were successfully implemented. Additional amplification steps are required for protocol completion