Actividad inhibitoria de glicógeno fosforilasa A de los extractos obtenidos desde las hojas de Ugni molinae Turcz. (murtilla) Myrtaceae : identificación de los principios activos

Abstract

Murtilla, Ugni molinae Turcz, es un arbusto autóctono que crece en forma silvestre y abundante desde la VII hasta la X región, conocida principalmente por sus frutos comestibles. La medicina popular le atribuye diversas propiedades tales como aromática, astringente, estimulante, alivia dolencias de la vía urinaria, entre otras. Sus hojas son utilizadas por la industria dermocosmética como regeneradora de la piel y neutralizadora del estrés oxidativo. Estudios previos realizados en nuestro laboratorio demostraron que las hojas de esta especie son una rica fuente de triterpenoides pentacíclicos derivados de los núcleos ursano, oleanano y lupano, a los cuales tanto en la literatura como estudios realizados en el laboratorio han establecido que poseen propiedades analgésicas, antiinflamatorias, antioxidantes e hipoglicemiantes. Siendo, esto último de relevancia, pues darían cuenta de propiedades antidiabéticas en las hojas de esta planta El objetivo de este trabajo fue aislar e identificar principios activos desde hojas de murtilla y ensayar actividad inhibitoria de diferentes extractos sobre la enzima glicógeno fosforilasa. En el presente trabajo, se utilizaron las hojas de esta especie, las cuales fueron secadas y trituradas para preparar distintos extractos por maceración hasta total agotamiento con solventes de polaridad creciente, obteniéndose los extractos de hexano (HEX), diclorometano (EDCM), acetato de etilo (EAE) y etanol (EET). Este último fue purificado mediante dos técnicas: extracción líquido-líquido y extracción sólido-líquido (Soxhlet) para así obtener una fracción rica en sapogeninas triterpénicas, cuyos productos se denominaron F-AcEt y SAE. Estas fracciones fueron repurificadas mediante sucesivas columnas cromatográficas de sílica gel y Sephadex® LH-20; y finalmente analizadas mediante placas cromatográficas preparativas para aislar una nueva genina denominada U7 y una mezcla de X y U7. U7 fue aislada e identificada como ácido madecásico (ácido 2α, 3β, 6β, 23 tetrahidroxi-urs-12(13)-eno-28-oico). En tanto que X aún no ha sido completamente identificada. La caracterización de los compuestos se realizó mediante espectroscopia de masa y espectroscopia de resonancia magnética nuclear unidimensional. El ensayo de inhibición de glicógeno fosforilasa a (GPa) fue realizado midiendo colorimétricamente a 660 nm la liberación del ión fosfato como producto de la reacción enzimática en dirección de la síntesis de glicógeno a partir de glucosa-1-fosfato. Las muestras a evaluar fueron disueltas en DMSO a una concentración de 60 μg/mL. Los resultados demostraron que un extracto estandarizado de Centella asiatica y sólo los extractos EAE, EET y sub-extracto SAE poseen actividad, obteniéndose los siguientes resultados de % inhibición frente a GPa ± SD: 53,8 ± 4,3; 45,9 ± 4,3; 92,2 ± 1,1 y 91,6 ± 1,2 respectivamente. La actividad de los extractos evaluados podría ser atribuida a los triterpenoides pentacíclicos presentes en estos extractos bioactivos. En síntesis se contribuyó a ampliar el conocimiento de la composición química de esta especie autóctona y se logró evaluar su efecto sobre GPa, otorgando grandes perspectivas en los estudios químicos-farmacológicos para esta especie nativa.

Murtilla, Ugni molinae Turcz is a native shrub that grows wild and abundant from VII to X region and it is known for its edible fruits. Folk medicine attributes to it many properties such as aromatic, astringent, stimulant, relieves ailments of the urinary tract, among others. Its leaves are used by dermocosmetics industry as regeneration of the skin and neutralizing oxidative stress. Previous studies in our laboratory showed that the leaves of this species are a rich source of pentacyclic triterpenoids derived from the ursane, oleanane and lupane skeletons, to which both the literature and our studies have established that have properties analgesic, inflammatory, antioxidant and hypoglycemic. Being the three latter of relevance since it would be linked antidiabetic properties in the leaves of this plant The aim of this study was to isolate and identify active ingredients from leaves of murtilla and evaluate their inhibitory activity of different extracts on the glycogen phosphorylase enzyme. Dry and powdered leaves were used to prepare different extracts by maceration until total exhaustion with solvents of increasing polarity obtaining the hexane (HEX), dichloromethane (EDCM), ethyl acetate (EAE) and ethanol (EET) extracts. The latter was purified by two techniques: liquid-liquid extraction and solid-liquid extraction (Soxhlet) to obtain a fraction rich in triterpene sapogenins, whose products were called F-AcEt and SAE. These fractions were repurified by successive silica gel and Sephadex LH-20 chromatographic columns, and finally by preparative chromatographic plates, to isolate a new genin called U7 and a mixture of X and U7. U7 was isolated and identified as madecassic acid (2α, 3β, 6β, 23 tetrahydroxy-urs-12(13)-ene-28-oic acid). While X has not been completely identified. The characterization of the compounds was performed by HPLC-ESI-MSn and 1H- and 13C-NMR . The inhibition assay of glycogen phosphorylase a (GPa) was determined colorimetrically at 660 nm by measuring the release of phosphate ion as a product of the enzymatic reaction toward the synthesis of glycogen from glucose-1-phosphate. The samples were dissolved in DMSO assessing a final concentration of 60 μg/mL. The results showed that a standardized extract of Centella asiatica and only EAE, EET extracts and SAE sub-extract possess activity with a inhibitory effect against GPa ± SD of: 53.8 ± 4.3; 45.9 ± 4.3; 92.2 ± 1.1 and 91.6 ± 1.2 % respectively. The activity of the evaluated extracts could be attributed to the bioactive pentacyclic triterpenoids present in these extracts. Briefly, this study allowed to increase the knowledge of the chemical composition of Ugni molinae leaves and assessing their effect on GPa, releasing great prospects in the chemical and pharmacological studies of this native species