Inhibición del complejo i como un posible mecanismo del daño oxidativo, mitocondrial y celular inducido por anti-inflamatorios no-esteroidales

Abstract

Los Anti-Inflamatorios No-Esteroidales (AINEs) son fármacos de estructura química heterogénea que tienen en común una acción anti-inflamatoria, anti-pirética y analgésica. Su mecanismo de acción comprende la inhibición de la enzima COX-2, responsable de la síntesis de prostaglandinas pro-inflamatorias. A pesar de su amplio uso y prescripción, los AINEs presentan importantes efectos secundarios a nivel gastrointestinal (GI). Si bien dichos efectos están parcialmente asociados a la inhibición de la isoforma COX-1, recientemente se ha postulado que, adicionalmente, la toxicidad de los AINEs implicaría una disfunción mitocondrial conducente a una caída en los niveles de ATP celular. Lo anterior desencadenaría un aumento de la permeabilidad del epitelio GI. Un evento importante en la síntesis de ATP mitocondrial es la transferencia de electrones a través de la cadena transportadora; lo anterior genera un gradiente de protones necesario para la fosforilación oxidativa. Siendo el complejo I un punto de entrada en la CTE, su inhibición redundaría no solo en una caída de ATP sino también en una mayor producción de anión superóxido (O2·-), lo que podría resultar en un incremento en el tenor oxidativo de la célula, conduciendo eventualmente a una pérdida de la viabilidad celular. Resultados recientemente obtenidos en el laboratorio en el que se desarrolló la presente tesis muestran que el AINE indometacina sería capaz de inhibir el Cx-I e incrementar la formación de O2·-. Un objetivo mayor de la presente tesis fue investigar si dicha inhibición es también observable con otros AINEs de estructura química diferente, como diclofenaco, piroxicam, ibuprofeno y aspirina. Los resultados obtenidos dan cuenta de que todos los AINEs testeados son capaces de inhibir el complejo I e incrementar la producción de superóxido. Dicha inhibición se demostró tanto en mitocondrias aisladas como en células Caco-2 expuestas a tales agentes. Los AINEs también incrementaron el tenor oxidativo y disminuyeron la viabilidad de células Caco-2. Desde un punto de vista mecanístico se observó que la inhibición del complejo I inducida por los diversos AINEs es totalmente reversible y susceptible a la competencia por parte de coenzima Q. A la luz de antecedentes que sugieren un potencial gastroprotector del flavonoide quercetina, y por ser éste capaz de acumularse preferentemente en la mitocondria, se estudió la capacidad que tendría quercetina para contrarrestar la inhibición del complejo I inducida por los AINEs y el incremento en los parámetros oxidativos que se desprenden de dicha inhibición. Tanto en mitocondrias aisladas como en células Caco-2 expuestas a AINEs, se comprobó que quercetina es capaz de proteger frente a la inhibición del complejo I y frente al aumento en la producción de superóxido mitocondrial inducidos por AINEs. Además, en células Caco-2, quercetina previno el aumento en el tenor oxidativo y la disminución en la viabilidad celular observada tras la exposición de dichas células a los diversos AINEs. Finalmente se estableció que, además de proteger contra la inhibición del complejo I, quercetina posee, aún a muy bajas concentraciones, la capacidad para actuar como un mimético de coenzima Q; en efecto, se estableció que quercetina permite el flujo normal de electrones, tanto a nivel del complejo I como entre los complejos I y III, y a lo largo de toda la cadena transportadora de electrones. En su conjunto, los resultados expuestos no solo dan cuenta de un posible mecanismo mediante el cual los AINEs inducirían toxicidad mitocondrial y celular, sino además, basado en la propuesta acerca del rol que supone la inhibición del complejo I en el desarrollo de la toxicidad de dichos agentes, la presente investigación sienta antecedentes experimentales acerca del potencial mecanismo que subyacería a un acción gastro-protectora de quercetina. Esto último se desprende de la evidencia en torno a la capacidad que tiene quercetina para prevenir la inhibición del complejo I inducida por los AINEs y para asegurar, además, a través de una acción “mimética de coenzima Q” el correcto funcionamiento de la cadena de transporte de electrones.

Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drugs (NSAIDs) are compounds of heterogeneous chemical structure that share anti-inflammatory, anti-pyretic and analgesic actions. Their mechanism of action involves the inhibition of COX-2, an enzyme responsible for the synthesis of pro-inflammatory prostaglandins. Despite their wide use and prescription, NSAIDs induce important gastro-intestinal side effects. Although those effects are mostly related to the COX-1 inhibition, it has been recently postulated that, additionally, NSAIDs-induced toxicity would involve a mitochondrial dysfunction, which would lead to decreased ATP levels and eventually to an increased gastro-intestinal permeability. An important event in the process of mitochondrial ATP synthesis is the transfer of electrons along the electron-transporting chain (ETC), which generates the necessary proton gradient that drives oxidative phosphorylation. Being complex I a major entrance point for the ETC, its inhibition would result not only in a diminished ATP synthesis, but also in a higher mitochondrial superoxide (O2·-) production. Under conditions in which the mitochondrial production of superoxide exceeds its antioxidant defense mechanisms, an increase in the mitochondrial and cellular oxidative tone would be expected; if the latter condition is not promptly controlled, it could eventually lead to a loss in cell viability. Recent studies conducted in the laboratory where this thesis was developed suggest that the NSAID indomethacin may inhibit mitochondrial complex I, increasing mitochondrial superoxide formation. A major objective of this thesis was to investigate whether the NSAIDs, diclofenac, piroxicam, ibuprofen and aspirin, which feature chemical structures different from that of indomethacin, are also able to inhibit complex I, as well as to induce a cytotoxicity similar to that induced by indomethacin. The results obtained in the present investigation show that all assayed NSAIDs are effective in inhibiting mitochondrial complex I, both in mitochondria isolated from rat duodenum epithelium and in mitochondria isolated from Caco-2 cells pre-exposed to the mentioned drugs. Additionally, NSAIDs increased mitochondrial superoxide production in both experimental models. In Caco-2 cells, NSAIDs also increased the oxidative tone and diminished cell viability. Mechanistically, NSAIDs-induced complex I inhibition was susceptible to competition and also reversible by coenzyme Q. Quercetin is a flavonoid with proven superoxide scavenging activity. Based on reports that suggest a potential gastro-protective activity of quercetin, and show its ability to effectively accumulate within mitochondria, the ability of quercetin to protect against NSAIDs-induced complex I inhibition and its oxidative effects was evaluated. In both isolated mitochondria and Caco-2 cells, quercetin was able to protect against the inhibition of complex I and the increase in mitochondrial superoxide production induced by all five NSAIDs. Furthermore, in Caco-2 cells quercetin effectively prevented the increase in the oxidative tone and the loss of cell viability observed after the incubation of such cells with each of the NSAIDs. Finally, it was established that in addition to protecting against NSAIDs-induced complex I inhibition, quercetin acts, even at very low concentrations, as a “coenzyme Q mimetic”; indeed, quercetin was shown to allow a normal electron flow at the complex I level and between complexes I and III of the ETC. Taken together, the exposed findings not only account for a putative mechanism for NSAIDs-induced mitochondrial and cellular toxicity, but also, based on the proposal that complex I inhibition plays an important role in NSAIDs-induced gastro-intestinal toxicity, the present research sets an experimental background on the potential mechanism that would underlie a gastro-protective action of quercetin. The latter arises from the evidenced ability of quercetin to prevent NSAIDs-induced complex I inhibition and its oxidative consequences, and from its ability to secure, by means of its “coenzyme Q mimetic” activity, the continuous operation of the mitochondrial electron- transporting chain.