Péptido [beta]-amiloide (1-42): estudio de potenciales inhibidores y desarrollo de un nuevo método de evaluación del proceso de agregación

Abstract

La polimerización y agregación del péptido Aβ1-42 son procesos poco dilucidados hasta el momento, sin embargo, están fuertemente relacionados al desarrollo de la Enfermedad de Alzheimer, trastorno neurodegenerativo, causante principal de demencia senil para el cual no existe cura o prevención efectiva hasta nuestros días. Una de las estrategias estudiadas con el fin de prevenir y buscar la cura de esta enfermedad es la de buscar compuestos que inhiban la agregación de Aβ1-42 y consecuentemente la formación de especies tóxicas que causan la muerte neuronal y el desarrollo de la enfermedad. En esta tesis se evaluó la acción inhibidora de la agregación de una serie de 6 derivados dihidropiridínicos (fenil-DHP, 3-OH-DHP, 4-OH-DHP, 3,4-OH-DHP, 3,5-OH- DHP y 3,4,5-OH-DHP) que difieren en el número y posición de hidroxilos en la molécula que por semejanzas estructurales con otros compuestos encontrados en la literatura se constituyeron en buenos candidatos para este fin. Estos compuestos poseen además las propiedades de ser inhibidores de la generación de radicales libres, inhibidores de canales de calcio y posibles antihipertensivos, constituyéndose en compuestos aún más atractivos, ya que el estrés oxidativo, el desbalance en la homeostasis de calcio y la hipertensión, son también factores desencadenantes de la EA.

Mediante las técnicas de Fluorescencia por Interacción con tioflavina-T, Electroforesis en Geles y TEM, los resultados demostraron que los compuestos con uno o ningún grupo hidroxilo (fenil-DHP, 3-OH-DHP y 4-OH-DHP) no son inhibidores de la agregación de Aβ1-42. Sin embargo, los compuestos , 3,4-OH-DHP, 3,5-OH-DHP y 3,4,5-OH-DHP son inhibidores de la agregación siendo 3,4-OH-DHP el compuesto más

eficaz con una inhibición máxima de 88±5% y una IC50 de 5.6±0.1µM siendo significativamente más potente que el resveratrol (IC50=9.8±1.3 µM), compuesto polifenólico usado como control en esta tesis. Los efectos sobre la toxicidad celular inducida por fibras amiloides fueron evaluados, para los compuestos activos, en cultivo primario de hipocampo de ratas E18; observándose que una inhibición en la agregación de Aβ1-42 está relacionada con una inhibición de la muerte celular inducida por fibras amiloides. Por otra parte, en esta tesis se desarrolló un nuevo método electroquímico que permite evaluar el proceso de agregación y desagregación de Aβ1-42 con el fin de complementar, con nueva información, la metodología existente, ya que los métodos convencionales poseen diversas limitaciones y no pueden ser constituidos como un único método válido. Se generaron electrodos de carbón vítreo modificados con nanotubos de carbono y fue posible seguir el proceso de agregación mediante la señal de oxidación del residuo de Tyr en estadios tempranos cuando oligómeros pequeños son formados, revelando información conformacional del extremo N-terminal de la molécula. Además, este nuevo método fue útil para evaluar la desagregación del péptido LPFFD-NH2, conocido desagregante.

Polymerization and aggregation of the Aβ1-42 peptide are not complete elucidated processes until now, however, they are strongly related to the development of Alzheimer's disease, a neurodegenerative disorder, the primary cause of dementia for which no cure or effective prevention exist so far. One of the strategies studied in order to prevent and to find a cure for this disease is to find compounds that inhibit the aggregation of Aβ1-42 and consequently the formation of toxic species that cause neuronal death and disease development. In this thesis, the aggregation inhibitory activity of a series of 6 dihydropyridine derivatives (phenyl-DHP, 3-OH-DHP, 4-OH-DHP, 3,4-OH-DHP, 3,5-OH-DHP and 3,4,5- OH-DHP) was evaluated. These compounds differ to each other in the number and position of hydroxyl groups in the molecule and since they have structural similarities with other compounds found in the literature they are constituted in good candidates for this purpose. These compounds also have other characteristics like inhibitors of free radical generation, calcium channel blockers and potential antihypertensive activity that make them more attractive since oxidative stress, the imbalance in calcium homeostasis and hypertension, are also triggers factors of Alzheimer's disease. By mean of Thioflavin-T Fluorescence Assay, Gel Electrophoresis and TEM the results demonstrated that the compounds with one or no hydroxyl group (phenyl-DHP, 3-OH-DHP and 4-OH-DHP) are not inhibitors of Aβ1-42 aggregation. However, the compounds, 3,4-OH-DHP, 3,5-OH-DHP and 3,4,5-OH-DHP are inhibitors of the aggregation being 3.4-OH-DHP the inhibitor compound with the highest maximum inhibition of 88 ± 5% and an IC50 of 5.6 ± 0.1μM being significantly more potent than resveratrol (IC50 = 9.8 ± 1.3 µM), a polyphenolic compound used as a control in this thesis.

The effects on cellular toxicity induced by amyloid fibrils were evaluated for these compounds in primary cultures of E18 rat hippocampus. It was observed that the inhibition on the aggregation of Aβ1-42 is related to the inhibition of cell death induced by amyloid fibers. On the other hand, in this thesis was developed a new electrochemical method to assess the process of aggregation and disaggregation of Aβ1-42 in order to supplement, with new information, the existing methodology, since conventional methods have several limitations and cannot be constituted as a single valid method. Glassy carbon electrodes modified with carbon nanotube were generated and it was possible to follow up the aggregation process by mean of the oxidation signal of Tyr residue in the early stages when small oligomers are formed, revealing conformational information of the N-terminal part of the molecule. In addition, this new methodology was useful for assessing the disaggregation activity of LPFFD-NH2 peptide, a known disaggregating compound.