Papel de Herp en la degradación de beclin-1 mediante el sistema ubiquitina-proteosoma

Abstract

La autofagia es un proceso fisiológico clave para la sobrevida celular frente a diferentes tipos de estrés. Este proceso degradativo consiste en el reclutamiento de proteínas, lípidos y organelos completos en vesículas de doble membrana para la posterior degradación lisosomal de su contenido. Una de las proteínas más importante en la regulación de la autofagia es Beclin-1/ATG6. En condiciones basales, Beclin-1 se encuentra unido a Bcl-2/Bcl-XL. La disociación de estas proteínas es indispensable para la activación de la autofagia. Tanto Beclin-1 como Bcl-2 son reguladas por modificaciones post-traduccionales que permiten su disociación. Dentro de estas modificaciones la poli-ubiquitinación en Lys63 de Beclin-1 promueve su disociación de Bcl-2 y la activación de la autofagia. Por otra parte, tanto la generación de estrés de retículo endoplasmático (RE) como la acumulación de agregados proteicos inducen autofagia. La respuesta a proteínas mal plegadas (UPR) restablece el normal funcionamiento del RE mediante distintas vías de señalización como la vía de degradación de proteínas del RE (ERAD), la cual elimina las proteínas mal plegadas dentro del RE al ser retrotranslocarlas hacia el citoplasma y poli-ubiquitinarlas para su degradación proteosomal. La acción del ERAD ocurre a través de un complejo formado por diferentes proteínas, entre ellas Herp y la ubiquitina ligasa Hrd-1/Synoviolina. El sistema ubiquitina-proteosoma modifica post-traduccionalmente proteínas, uniéndolas covalentemente a una pequeña proteína denominada ubiquitina. La unión de varias subunidades de ubiquitina unidas por su Lys48 es conocida como poli-ubiquitinación en Lys48 y está generalmente asociada a la degradación proteosomal de la proteína marcada. Por otra parte, otros tipos de cadenas de poli-ubiquitina unidas por su Lys63 tendrían funciones de señalización. Herp es una proteína integral de membrana asociada al RE, la cual aumenta significativamente sus niveles en respuesta al estrés del RE y activarse la vía UPR. Herp posee un dominio análogo a ubiquitina (ULD), el cual lo vincularía al ERAD. El dominio ULD de Herp regula positivamente la poli-ubiquitinación dependiente de Hrd-1 y de esta manera aumenta la degradación de sustratos específicos de esta enzima. Estudios recientes en nuestro laboratorio mostraron que Herp actúa como un regulador negativo de la autofagia y que los niveles de Beclin-1 aumentan significativamente en su ausencia. El objetivo de esta tesis fue establecer el mecanismo a través del cual Herp regula negativamente la autofagia. Con este fin se prepararon células HeLa “knock-down” (KD) para Herp mediante la expresión de un shRNA específico. También se utilizaron siRNA específicos para Herp con el fin de reducir los niveles de esta proteína en células HeLa “wild-type”. Los resultados obtenidos muestran que Herp regula positivamente la poli-ubiquitinación en Lys48 de Beclin-1. Ni la privación de glucosa ni la disminución de Hrd-1 mediante un siRNA específico produjeron diferencias en la poli-ubiquitinación de Beclin-1. La inhibición del proteosoma con MG132 indujo un aumento en la cantidad de Beclin-1 en células controles, mientras que las células Herp KD no presentaron diferencias con respecto al control, sugiriendo que la poli-ubiquitinación por Lys48 de Beclin-1 conduce a su degradación proteosomal. Sin embargo al activar la autofagia por privación de glucosa las células tratadas con el siRNA de Herp o siRNA de Herp y Hrd-1 en conjunto mostraron una tendencia al aumento en la autofagia, mientras que las células transfectadas con el siRNA de Hrd-1 mostraron una disminución de la activación de la autofagia. En conclusión los resultados solo comprueban parcialmente la hipótesis propuesta. Si bien se observó que Herp regula negativamente la autofagia mediante la poli-ubiquitinación en Lys48 de Beclin-1 y su consiguiente degradación proteosomal, la ubiquitin ligasa Hrd-1 no sería la encargada de la poli-ubiquitinación en Lys48 dependiente de Herp.

Autophagy is a key physiological process for cell survival under different types of stress. This process consists in the recruitment of various cytoplasmatic components such as proteins, lipids and organelles into double-membrane vesicles which fuse with lysosomes enabling the degradation of its content. One of the most important regulatory proteins in autophagy is Beclin-1/ATG6. In basal conditions, Beclin-1 interacts with its repressor protein Bcl-2/Bcl-XL. The dissociation of these two proteins is indispensable for autophagy initiation and development. Both Beclin-1 and Bcl-2 are subjected to different post-translational modifications, which regulate their dissociation. Among these modifications, the Lys63 poly-ubiquitination of Beclin-1 promotes dissociation from Bcl-2 and autophagy activation. The generation of endoplasmic reticulum (ER) stress and the subsequent accumulation of misfolded proteins is a well known autophagy activating signal. In order to maintain homeostasis to the ER during stress, the unfolded protein response (UPR) is activated. The UPR accomplishes this task by a series of signaling pathways such as ER-associated protein degradation (ERAD), which degrades misfolded proteins inside the ER by retro-translocation of them to the cytoplasm and poly-ubiquitination for proteosomal degradation. ERAD is controlled by a series of proteins in the ER such as Herp and the ubiquitin-ligase Hrd-1/Synoviolin. The ubiquitin-proteasome system modifies proteins by the attachment of the small protein ubiquitin. Attaching several subunits of ubiquitin to each other by their Lys48 is called Lys48 poly-ubiquitination and is normally recognized as a signal for proteasome degradation. In the other hand, Lys63 poly-ubiquitination of proteins is related to other signaling process. Herp is an integral ER protein, whose levels are significantly increased during ER stress and UPR activation. Herp contains an ubiquitin-like domain (ULD) which has been associated with ERAD. Herp ULD domain controls Hrd-1 dependant poly-ubiquitination, increasing the poly-ubiquitination and proteasomal degradation of specific substrates of Hrd-1. Our recent studies have shown that Herp is a novel negative regulator of autophagy and Beclin-1 levels are up-regulated in the absence of Herp. The aim of the present work was to establish how Herp negatively regulates autophagy. To this end, Herp knock-down (KD) HeLa cells were prepared by expressing a specific shRNA. Specific siRNA were also used to silence Herp expression in HeLa wild-type cells. Our results show Herp positively regulates Beclin-1 Lys48 poly-ubiquitination. Both glucose deprivation and Hrd-1 siRNA treatment did not have any effect in Beclin-1 poly-ubiquitination. Proteasome inhibition with MG132 induces Beclin-1 levels in control cells, while Herp KD cells do not show any differences. These data suggest that Beclin-1 lysine-48 poly-ubiquitination leads to its proteasome degradation. Glucose deprivation showed an increase in autophagy activation cells treated with a Herp siRNA or Hrd-1 and Herp siRNA treated cells. However, Hrd-1 siRNA treatment alone showed impaired autophagy activation. In conclusion, our results only prove the hypothesis partially. The results suggest Herp negatively regulates autophagy through Beclin-1 Lys48 poly-ubiquitination and consequent proteasomal degradation, but the ubiquitin ligase Hrd-1 would not be responsible Herp mediated Beclin-1 Lys48 poly-ubiquitination.