Evolución dirigida mediante mutagénesis por saturación de la xilanasa L de origen marino antártico

Abstract

Las proteínas psicrófilas resultan muy útiles a nivel industrial pues permiten un ahorro de energía por presentar una alta actividad específica a bajas temperaturas en comparación con sus homólogas mesófilas (activas a temperaturas moderadas). En esta tesis se utilizó la enzima Xilanasa L, proveniente de bacterias psicrófilas de origen marino antártico, la cual es activa a bajas temperaturas. Las xilanasas son muy utilizadas en la industria, especialmente en el procesamiento del papel y degradación de fibras vegetales. La ventaja de las enzimas psicrófilas es que poseen una eficiencia catalítica aumentada, producto de adaptaciones que han tenido que desarrollar para superar las bajas temperaturas, las cuales inhiben al común de las enzimas mesófilas. Todas las enzimas adaptadas al frío encontradas en la naturaleza tienen el inconveniente de tener su estructura molecular demasiado flexible, lo que provoca una perdida de su conformación a moderadas y altas temperaturas, por ende pérdida de actividad. A través de técnicas de ingeniería de proteínas es posible obtener una variante más termoestable al rediseñar la estructura para ganar rigidez, pero sin disminuir su actividad a bajas temperaturas. Para lograr esto, se usó el análisis de dinámica molecular y el diseño racional para la elección de los sitios a mutar dentro del dominio catalítico de acuerdo al movimiento de cada residuo y así obtener una enzima con las características deseadas. Mediante mutagénesis por saturación, se generaron mutantes simples, obteniendose bibliotecas de 176 clones para cada aminoácido seleccionado. Se escogieron los clones más termoestables de cada biblioteca luego de una búsqueda (screening) rápida mediante ensayos enzimáticos. Se obtuvo una nueva xilanasa, llamada “DM1”, la cual resultó ser una proteína truncada. Ésta nueva xilanasa se caracterizó bioquímicamente y se comparó con la enzima templado. Se determinó que la enzima templado posee 752 residuos aminoacídicos, con una masa total de 83.15 kDa. Se alcanzó la temperatura óptima a los 41°C, y un pH óptimo de 9.2. Los parámetros cinéticos calculados por el método de Lineweaver-Burk fueron una constante de afinidad (Km) de 2.003 mg/mL y una Vmax de 0.100 . La Xilanasa DM1 posee 638 residuos aminoacídicos con una masa de 70.42 kDa, una temperatura óptima de 41°C y un pH óptimo de 6.3. Esta enzima posee una Km de 0.980 mg/mL y la Vmax fue 0.063 . La Xilanasa DM1 mejoró en 5°C su termoestabilidad frente a un shock térmico de 7 min. Las razones del aumento de la termoestabilidad en esta nueva variante de Xilanasa L no están claras pero podemos especular sobre esto. Para entender el efecto de la deleción del extremo C-terminal es necesario un modelamiento de la estructura completa de la enzima DM1. Esta nueva variante podría ser un primer paso para continuar la mejora de la xilanasa psicrófila.

The psychrophilic enzymes are very useful in the industry because they allow energy savings by its higher specific activity at low temperatures in comparison with their mesophilic homologues (active at moderate temperatures). In this thesis we used the Antarctic sea water Xylanase L which is active in low temperatures. Xylanases are very important, especially in the paper industry and degradation process of vegetable fibers. The advantage of the psychrophilic enzymes is that they have an increasing catalytic efficiency because they have developed strategies to overcome the low temperatures which inhibit the reactions catalyzed by mesophilic enzymes. All cold-adapted enzymes found in nature have the disadvantage of their high structural flexibility which causes a loss of their structural conformation at moderate to high temperatures, losing their catalytic activity. Through protein engineering we can redesign the enzyme structure in order to decrease the flexibility without a loss of low-temperature activity. We used molecular dynamics analysis and rational design to choose the residues for mutagenesis in the catalytic domain according to their movement. The chosen method was saturation mutagenesis through single mutant generation. We obtained 176 clones for each library. We choose the ones that show a higher thermostability in the enzymatic screening. We produced a new xylanase called “DM1”, which is a truncated protein. We did a biochemical characterization and compare it with the template enzyme. We determinated that the template enzyme had 752 residues, with a theoretical mass of 83.15 kDa. Its optimal temperature and pH was 41°C and 9.2, respectively. The kinetic constants obtained using Lineweaver-Burk method were Km=2.003 mg/mL and Vmax=0.100 . The Xylanase DM1 had 638 residues with a theoretical mass of 70.42 kDa, an optimal temperature of 41°C and an optimal pH of 6.3. This enzyme have a Km=0.980 mg/mL and a Vmax=0.063 . The Xylanase DM1 increased their thermostability in 5°C in a 7 minutes thermal shock. Altough the cause of the increase of thermostability of this new Xylanase L are not very clear, we can speculate about that. In order to understand the effects of the deletion of the C-terminal, is necessary a modeling of the complete structure of the DM1 enzyme. This new variant could be the first step of the improvement of the psychrophilic xylanase.