Efectos de la noradrenalina sobre la complejidad dendrítica en cultivos de neuronas hipocampales

Abstract

La neurotransmisión noradrenérgica está relacionada con procesos como el aprendizaje y la memoria. Se ha observado en el cuadro depresivo una disminución en la neurotransmisión de noradrenalina (NA), alteraciones de la arquitectura dendrítica y la disminución de los niveles de factores tróficos como el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF). El hecho de que una variación de los niveles de NA pueda activar diferentes receptores adrenérgicos en el espacio sináptico, podría explicar en parte los mecanismos de plasticidad sináptica involucrados en cambios morfofuncionales, desde acciones sobre la complejidad dendrítica hasta la modulación sobre procesos complejos como aprendizaje y memoria. Esta noción es apoyada por el hecho de que los fármacos que incrementan los niveles de NA en el espacio sináptico revierten la atrofia dendrítica observada en modelos animales de depresión, y recuperan el deterioro cognitivo. En base a estos antecedentes hemos propuesto en esta Tesis que: “La activación de receptores β‐adrenérgicos promueve un aumento en la complejidad dendrítica en cultivos primarios de neuronas hipocampales”. Se obtuvieron cultivos hipocampales de ratas en estado fetal de 18 días (E18), y se cultivaron durante 7 días in vitro (7 DIV). En estos cultivos se evaluó a través de Western Blot la respuesta frente a la estimulación de receptores β‐adrenérgicos, midiendo la fosforilación de la Proteína de Unión al Elemento de Respuesta al AMP cíclico (CREB) frente a estímulos cortos (5‐ 15 minutos) con noradrenalina (100 nM) en ausencia y presencia del β‐antagonista propranolol (10 μM). Junto con ello, se observó la distribución de CREB fosforilado a través de inmunocitoquímica luego de estímulos de 2 horas con los mismos fármacos. No fue posible a través de estas técnicas observar modificaciones en la intensidad de la señal o la distribución de p‐CREB. Sin embargo, la adición de NA fue capaz de promover un incremento en el calcio citosólico, como se demostró a través del uso de sondas fluorescentes, y una reducción en la actividad neuronal evaluada por registros whole-cell. Los cultivos a los 7 DIV presentan receptores β2‐adrenérgicos, visualizados a través de Western Blot. Más aún, estudios de inmunocitoquímica muestran que el receptor β2 presenta una distribución principalmente somatodendrítica. A través de la estimulación farmacológica de los cultivos durante 24 horas con NA 100 nM o clenbuterol 25 nM, en ausencia y presencia de propranolol 10 μM, se estudió si la activación de receptores adrenérgicos modula la morfología dendrítica. Ésta fue evaluada a través de la medición de puntos de intersección (Análisis de Sholl), puntos de ramificación, largo y número de dendritas. La estimulación con clenbuterol 25 nM no produjo efecto sobre ninguno de estos parámetros, descartando la participación de los receptores β2‐ adrenérgicos en la arquitectura dendrítica. Tampoco produjo efectos en la morfología de las dendritas la administración por separado de noradrenalina o propranolol. Sin embargo, los cultivos estimulados con NA posterior a la incubación con propranolol mostraron una reducción en el número de intersecciones del análisis de Sholl en el rango de los 30‐80 μm en comparación con el control. Estos cambios están acompañados por un descenso en el largo total de las dendritas primarias, y en particular de las dendritas primarias mayores a 40 μm, sin que el número de dendritas primarias por neurona se viera modificado. Un efecto similar se observó en las dendritas secundarias. Estos resultados sugieren que los cambios en el largo dendrítico observados probablemente no se asocian a la activación de receptores β2‐adrenérgicos. Proponemos que la activación de receptores α‐ y β1‐adrenérgicos regularían la morfología neuronal, probablemente con efectos opuestos, controlando el largo dendrítico de las dendritas primarias y secundarias de mayor tamaño. El estudio realizado en esta Tesis por primera vez describe efectos de la activación de receptores adrenérgicos sobre la morfología neuronal, pudiendo explicar en parte los cambios morfológicos y mejoría cognitiva tras el tratamiento de fármacos que incrementan los niveles de NA en el espacio sináptico

Noradrenergic neurotransmission is related with processes as learning and memory. In depressive behavior, it has been observed a decrease in noradrenaline (NA) neurotransmission, alterations on dendritic arborization and a decrease in levels of trophic factors, such as brain derived neurotrophic factor (BDNF). The fact that different levels of NA can activate different adrenergic receptors at synaptic cleft, could explain part of synaptic neuroplasticity mechanisms involved in morphofunctional alterations, from actions on dendritic complexity to modulation of complex processes as learning and memory. This notion is supported by the fact that drugs that increase levels of NA at synaptic cleft reverse dendritic atrophy observed in animal models of depression, and recover cognitive impairment. Considering these antecedents, this Thesis proposed that: “Activation of β‐adrenergic receptors promotes an increase in dendritic complexity in primary cultures of hippocampal neurons”. Hippocampal primary cultures were obtained from embryonic day 18 (E18) Sprague‐Dawley rat fetuses, and cultured for 7 days in vitro (7DIV). In these cultures, changes in phosphorylation of cAMP‐response element binding protein (CREB) were evaluated by Western Blot, in response to short stimulus (5‐15 min) with 100 nM NA in absence and presence of 10 μM propanolol, a β‐adrenergic receptor antagonist. In addition, levels of phosphorylated CREB (p‐CREB) were measured by immunocytochemistry, after stimulation of 2 hours with the same drugs. It was not possible to observe modifications on signal intensity of p‐CREB through these techniques. However, the addition of NA promoted an increase in cytosolic calcium, measured by fluorescent probes for calcium, and a reduction of neuronal activity evaluated by whole‐cell recording. The 7 DIV cultures showed β2‐adrenergic receptors, which were visualized by Western Blot. Moreover, immunocytochemistry studies showed that β2‐adrenergic receptor was distributed in neurons mainly in the somato‐dendritic compartment. Through pharmacological stimulation of cultures for 24 hours with 100 nM NA or 25 nM clenbuterol, with 10 μM propranolol absent or present, the activation of adrenergic receptors and their role in dendritic morphology has been measured. Morphology was evaluated through the measurement of intersection points (Sholl Analysis), branching points, and dendritic length and number. Stimulation with 25 nM clenbuterol did not have effect on any of these parameters, thus any role of β2‐adrenergic receptors in dendritic architecture was discarded. Neither administration of NA nor propranolol alone produced effects on dendrite morphology. However, NA‐stimulated cultures after incubation with propranolol showed a reduction in the number of intersections in Sholl analysis compared with controls, in the 30‐80 μm range. Those changes were accompanied by a reduction in primary dendrites greater than 40 μm, without any modifications in primary dendrite number per neuron. A similar effect was shown in secondary dendrites. These results suggest that changes observed in dendritic length were probably not associated with the activation of β2‐adrenergic receptors. We propose that the activation of α‐ and β1‐adrenergic receptors may regulate neuron morphology, probably with opposite effects, controlling dendritic length of longer primary and secondary dendrites. The study carried out in this Thesis describes for first time the effects of adrenergic receptors activation in dendrite morphology, and may explain in part the morphological changes and cognitive improvement after treatment of drugs that increase levels of NA in the synaptic cleft