Isoformas del receptor TRKA y su relación con ADAM17 en el cáncer ovárico epitelial

Abstract

El receptor de alta afinidad de la neurotrofina NGF, TRKA, ha sido asociado con distintos tipos de cáncer, pudiendo encontrarse isoformas de este receptor. En el cáncer ovárico no se han descrito isoformas de este receptor, sin embargo, se ha determinado un aumento de la forma activa de TRKA, relacionándolo con una baja sobrevida. En una línea celular de ovario de hámster chino, el ectodominio de TRKA puede ser liberado mediante un corte proteolítico, quedando activado constitutivamente un fragmento del receptor formado por los dominios intracelular y transmembrana. La detección de este fragmento disminuye al expresar una forma inactiva de ADAM17 (una de las proteasas más estudiadas de la familia de proteínas ADAMs). Estos antecedentes llevaron a postular que en el cáncer ovárico epitelial humano se expresan isoformas del receptor TRKA, siendo una o más de ellas, cortada por ADAM17, resultando en la detección de una forma proteica fosforilada adicional del receptor, constituida sólo por sus dominios intracelular y transmembrana. Para lograr los objetivos de este trabajo se realizaron experimentos ex–vivo en muestras de tejidos ováricos humanos, con el fin de determinar la presencia de transcritos e isoformas del receptor TRKA, además de los niveles proteicos de ADAM17. También, se realizaron experimentos in-vitro con líneas celulares de ovario humano, para evaluar las isoformas de TRKA que experimentan un corte por efecto de ADAM17. Resultados de este trabajo mostraron la presencia de tres transcritos del receptor TRKA en ovario, con mayores niveles en muestras de cáncer más avanzado. Detectamos tres isoformas de este receptor en muestras de ovario y, adicionalmente, una isoforma de TRKA-p de 41kDa, cuyos niveles se encuentran aumentados en muestras de cáncer ovárico. Adicionalmente, encontramos mayores niveles proteicos de ADAM17 en muestras de cáncer ovárico avanzado, en comparación con muestras de tumores borderline. También se encontró una correlación positiva entre los niveles proteicos de ADAM17 y de TRKA en cáncer ovárico e, interesantemente, se observó una sob posici n (“merge”) s tincion s ambas proteínas al realizar la Inmunofluorescencia. Nuestros resultados muestran por primera vez la presencia de tres transcritos e isoformas de TRKA en ovario humano, además de una forma corta de TRKA-p (41 kDa), posiblemente producto de un corte proteolítico por la potencial acción de ADAM17. La presencia de una isoforma truncada fosforilada del receptor TRKA en cáncer ovárico epitelial tendría gran utilidad clínica, ya que podría servir como marcador pronóstico y como posible blanco terapéutico

TRKA is the high affinity receptor for the neurotrophin NGF. There are reports about isoforms of this receptor, but so far none have been detected in ovary. Phosphorylated TRKA receptor (p-TRKA) is highly expressed in epitelial ovarian cancer; nevertheless, it is not known if TRKA is post-translationally processed to smaller molecular forms in ovarian carcinoma. Earlier studies in cell lines have shown that TRKA is proteolytically cleaved by the metalloprotease ADAM17, resulting in an isoform containing the phosphorylated transmembrane and cytosolic domains of the receptor. Therefore, the aim of this study was the detection of isoforms of TRKA receptor in epithelial ovarian cancer, being one or more of them cleaved by ADAM17, resulting in an additional phosphorylated form of TRKA, containing its transmembrane and cytosolic domains. We analyzed the TRKA mRNA and protein levels, as well as protein levels of ADAM17, in human tissues. We also studied the cellular localization of these proteins in human cell lines. Using PCR analysis, we found three transcripts of TRKA in ovary, with higher levels in poorly differentiated epithelial ovarian cancer tissues. On the other hand, we found three isoforms of the receptor, as well as an additional form of 41 kDa by Western blot; with higher levels of these isoforms of TRKA in cancer samples. When ADAM17 was evaluated in ovarian tissues by immunohistochemistry, we found that this protein was mostly seen in epithelial cells, and a progressive increase in protein abundance with the progression of epithelial ovarian cancer. We also found a positive correlation between ADAM17 and TRKA protein levels in ovarian cancer, as well as a merge between both proteins by immunofluorescence. These results show for the first time the presence of isoforms of TRKA in ovary, as well as an additional form of 41 kDa of the receptor Besides, ADAM17 and the different isoforms of the TRKA receptor levels were found to be higher in more advanced stages of the disease. Also, a positive correlation was found between ADAM17 and TRKA receptor levels during different stages of ovarian cancer. This additional phosphorylated form of the TRKA receptor found in ovarian cancer tissues may be of great clinical significance, since it could be used as a new therapeutic target