Efecto de la carencia de polifosfatos inorgánicos en la expresión global de proteínas y en los determinantes de resistencia a cobre en el arqueón sulfolobus solfataricus

Abstract

Mientras los mecanismos de resistencia al cobre han sido ampliamente estudiados en bacterias, se tiene escasa información sobre los mecanismos de resistencia al cobre en arqueas. Recientemente se ha identificado un grupo de genes (cop) de resistencia al cobre, altamente conservado en las arqueas del orden Sulfolobales. Este grupo de genes incluye un regulador transcripcional específico de arqueas (copR), una metalochaperona de cobre (copT) y un transportador de cationes ATPasa tipo P (copA). Otro posible mecanismo de resistencia al cobre en Sulfolobales comprendería a los polifosfatos (poliP). Los poliP son moléculas lineales presentes en todos los seres vivos y que cumplen diversas funciones celulares. El modelo que vincula los poliP con la resistencia a cobre propone una disminución de poliP mediada por la exopolifosfatasa (PPX), enzima que degradaría el gran polímero hasta fosfato inorgánico (Pi), el cual podría unirse a cobre para ser finalmente expulsado hacia el periplasma o al medio extracelular por transportadores específicos. Recientemente nuestro laboratorio ha logrado generar una cepa de Sulfolobus solfataricus recombinante con niveles deficientes de poliP, con el fin de evaluar el efecto de su carencia en distintos fenómenos, entre ellos la resistencia a cobre. Basados en estudios transcripcionales realizados mediante la técnica PCR en tiempo real, determinamos que la inducción de la expresión de copA en respuesta a cobre ocurre más tempranamente en células carentes de poliP, comparadas con células que poseen este polímero. Una explicación a este fenómeno sería que en ausencia de poliP, el modelo que vincula los poliP con el eflujo de cobre no sería operativo. En consecuencia, el sistema cop debería ser activado más tempranamente para compensar la carencia de poliP. Con el objetivo de profundizar en el conocimiento que se tiene sobre los poliP y su relación con la resistencia a cobre en S. solfataricus, analizamos la expresión diferencial de proteínas en células carentes de poliP y en células expuestas a cobre. De esta forma, mediante la técnica de proteómica cuantitativa ICPL determinamos que en carencia de poliP las células de S. solfataricus sobreexpresaron proteínas involucradas en la degradación de glucógeno y ácidos grasos, junto a aquellas que remueven especies reactivas del oxígeno (ROS). Por otro lado, algunas de las proteínas que disminuyeron sus niveles en carencia de poliP están involucradas en la gluconeogénesis y el ciclo del glioxilato. Estos resultados en conjunto, sugieren que los poliP podrían desempeñar un papel energético en S. solfataricus, ya que al parecer, en su ausencia se favorecen las vías catabólicas. La sobreexpresión de proteínas que remueven ROS sugiere un mayor estado de estrés oxidativo en las células S. solfataricus poliP-. Adicionalmente, los experimentos de proteómica cuantitativa nos permitieron determinar que en presencia de cobre, las células de S. solfataricus poliP+ sobreexpresan proteínas involucradas en el ciclo del TCA, en la degradación y plegamiento de proteínas, la reparación del ADN y en la degradación del ARN. Estos resultados sugieren que la presencia de cobre podría provocar daño a tanto a nivel de proteínas, como de ácidos nucleicos en las células de S. solfataricus. El aumento en los niveles de algunas proteínas involucradas en el ciclo del TCA puede relacionarse con el ATP y el poder reductor que las células necesitan para enfrentar una situación de estrés (ej: proteólisis, plegamiento de proteínas). Finalmente, las células carentes de poliP y expuestas a cobre aumentaron los niveles de algunas proteasas, de proteínas que forman parte de la cadena transportadora de electrones y de proteínas que participan en la remoción de ROS, como la peroxiredoxina y la superóxido dismutasa (SOD). Si bien la peroxiredoxina se aumentó sus niveles en todas las condiciones de estudio, la SOD sólo lo hizo cuando las células de S. solfataricus carentes de poliP, fueron expuestas a cobre. En conjunto estos resultados sugieren un mayor nivel de estrés oxidativo en las células S. solfataricus poliP- expuestas a cobre y un papel energético de los poliP. Dentro de las proteínas que disminuyeron sus niveles, encontramos proteínas ribosomales. Esto podría incidir directamente en la síntesis proteica, disminuyendo la capacidad de las células de S. solfataricus poliP- de hacer frente a una situación de estrés

While copper resistance mechanisms have been widely studied in bacteria, there is little information about copper resistance mechanisms of Archaea. Recently, a highly conserved group of genes (cop) related to the resistance to copper was identified in some species of Sulfolobales. This group of genes consists of an archaeal-specific transcriptional regulator (copR), a putative metallochaperone (copT) and a P-type cation-transporting ATPase (copA). Another potential mechanism involved in copper resistance of Sulfolobales would involve inorganic polyphosphates (polyP). PolyP is a linear polymer present in all organisms and performs a wide variety of functions. The model that links polyP with resistance to copper suggests that the exopolyphosphatase (PPX) mediates the degradation of polyP to inorganic phosphate (Pi) which could eventually join copper and be finally ejected to the periplasm or to the extracellular medium by specific transporters. Recently, our laboratory has generated a recombinant Sulfolobus solfataricus strain deficient in polyP levels, in order to evaluate the role of its deficiency in various phenomena, including copper resistance. Based on transcriptional studies carried out through real-time PCR, we determined that the induction of the expression of copA in response to copper occurs earlier in cells lacking polyP, than those possessing the polymer. One explanation for this phenomenon could be that, in the absence of polyP, the model linking polyP to copper efflux would not be operational. As a consequence, the cop system should be activated earlier to compensate for the lack of polyP. To gain insight into polyP and its relationship to copper resistance in S. solfataricus, we studied the differential expression of proteins in cells lacking polyP and in cells exposed to copper. Thus, quantitative proteomics studies (ICPL) showed that in the absence of polyP S. solfataricus cells overexpresses proteins involved in: the degradation of glycogen and fatty acids, and in the removal of reactive oxygen species (ROS). On the other hand, some of the proteins that decreased their levels are involved in gluconeogenesis and the glyoxylate cycle. These results suggest that polyP could play an energetic role in the cell considering that the lack of this polymer, upregulated proteins involved in catabolic pathaways. The upregulation of proteins involved in removal of ROS suggests the presence of a higher level of oxidative stress in S.solfataricus poliP- cells. Further, ICPL experimentas allowed us to determine that in the presence of copper, S. solfataricus polyP+ cells overexpress proteins involved in: the TCA cycle, the degradation and folding of proteins, DNA repairing, and in RNA degradation. These results suggest that the presence of copper could cause damage to both proteins and nucleic acids from S. solfataricus cells. The up-regulation of some TCA proteins could be related with the ATP levels and reducing power that cells need to face a stress situation (e.g. proteolysis, folding of proteins). Finally, when cells lacking polyP were exposed to copper, there was an overexpression of proteases, electron transport chain proteins, and proteins involved in ROS removal (peroxiredoxin and SOD). Although peroxiredoxin was overexpress in all our study conditions, SOD was only up-regulated when S. solfataricus polyP- cells were exposing to copper. These findings may reflect a higher oxidative stress in cells lacking polyP and also suggest an energetic role of polyP. Some of the proteins that decreased their levels were ribosomal proteins. This could directly affect protein synthesis and therefor the ability of S. solfataricus polyP- cells to respond to a stressing situation