Estudio de la vía de señalización asociada a la retracción/inhibición de crecimiento neurítico, mediada por las interacciones [alfa]v[beta]3/Thy-1 en cultivos neuronales

Abstract

Previamente describimos que la interacción entre Thy- 1 neuronal y la integrina αvβ3 presente en astrocitos aumenta la fosforilación inhibitoria de Src, provoca retracción de neuritas e inhibe el crecimiento de éstas. Sin embargo, Thy- 1 es una proteína anclada a la membrana vía un glicoplípido (GPI) y carece de dominios transmembrana e intracelular, y por lo tanto no puede transducir señales al interior de la célula. Aquí, evaluamos si la proteína que une a Csk (CBP), una proteína de andamiaje para las quinasas de la familia de Src, actúa como un transductor de Thy-1 y estudiamos los acontecimientos de señalización río abajo que causan la retracción de las neuritas desencadenada por la interacción de Thy-1 con Integrina αvβ3 . Para estudiar estas vías de señalización, se utilizaron dos modelos celulares diferentes. El primero de ellos fue células CAD; estas células se pueden diferenciar a un fenotipo neuronal por privación de suero. Luego estimulamos las células con la proteína fusión de Integrina αvβ3-Fc para estudiar su efecto. El segundo fue neuronas corticales de rata de 14 días en cultivo. Después de este período, también estimulamos añadiendo Integrina αvβ3. En ambos modelos se analizó el efecto de Integrina en la composición del complejo de membrana conformado por Thy-1, CBP y Src. Realizamos ensayos de inmunoprecipitación, microscopía STED, análisis de inmunofluorescencia entre otros. La participación de CBP, Src y RhoA también se evaluaron con herramientas de biología molecular y además se analizó el estado de fosforilación de sus efectores. Encontramos que Thy 1, CBP y Src forman un complejo funcional en los procesos neuronales que induce la inactivación de Src. Además, la adición de Integrina αvβ3 aumentó la activación de RhoA y su efector ROCK, eventos que causan la retracción de las neuritas a través de la disrupción del citoesqueleto de actina. Por otro lado, la utilización de una construcción de Src constitutivamente activa o el silenciamiento de CBP bloqueó la retracción neuronal causado por la interacción con Integrina αvβ3. Aquí, se propone un mecanismo molecular novedoso gatillado por la unión de Integrina αvβ3 astrocitaria a Thy-1 que involucra el agrupamiento de Thy-1 y la formación de un complejo de membrana el que a través de la activación de RhoA/ROCK lleva a la retracción de las neuritas. Una mejor comprensión de las vías de señalización implicadas en la comunicación celular entre las neuronas y astrocitos, que generan un ambiente no permisivo para la regeneración neuronal, debería ser útil en el desarrollo de nuevas terapias farmacológicas para ayudar a re-establecer redes neuronales dañadas

We have previously described that the interaction between neuronal Thy-1 and αvβ3-Integrin in astrocytes increases the inactivating phosphorylation of Src, causes neurite retraction and inhibits neurite outgrowth. Thy-1 is a GPI-anchored membrane protein, which lacks membrane-spanning and cytosolic domains and therefore cannot directly transduce signals to the cell interior. Thus, we evaluated whether Csk-Binding-Protein (CBP), a scaffolding protein for Src-family kinases, acts as a Thy-1 transducer and studied the downstream signaling events that cause neurite retraction triggered by Thy-1 interaction with αvβ3 Integrin. To study these signaling pathways, we used two different cellular models. The first one was CAD cells which can be differentiated to a neuronal phenotype by serum deprivation. Afterwars we added a fusion protein αvβ3 Integrin-Fc. The second one was rat cortical neurons of 14 days in culture. Following this period, these cells were also stimulated the cells by adding the αvβ3 Integrin. In both models we analyzed the effects of the Integrin the composition of the Thy-1, CBP and Src membrane complex. We performed immunoprecipitation assays, STED microscopy and immunofluorescence analysis among other assays. CBP, Src and RhoA participation was also evaluated using molecular biology approaches and by analyzing the phosphorylation state of downstream effectors. We found that Thy-1, CBP and Src form a functional complex in neuronal processes that induces Src inactivation. Furthermore, treatment with αvβ3-Integrin increased the activation of RhoA and its effector ROCK, both of which induce neurite retraction through the Actin cytoskeleton disruption. On the other hand, constitutively active Src or CBP abrogation prevented neuronal retraction caused by αvβ3 Integrin engagement. Here, we propose a novel molecular mechanism triggered by the binding of astrocytic αvβ3 Integrin to Thy-1 that involves Thy-1 clustering and the formation of a membrane complex with that through RhoA/ROCK activation leads to neurite retraction. A better understanding of the signaling pathways involved in cellular communication between neurons and astrocytes that generate a non-permissive environment for neuronal regeneration should be helpful to develop new therapies to help re-establishing damaged neuronal networks