Evaluación de la participación de sinaptotagmina-i y la dinámica de distribución de Ca2+ en la hipofunción glandular en pacientes con Síndrome de Sjögren

Abstract

El Síndrome de Sjögren (SS) es una enfermedad autoinmune sistémica, que afecta a las glándulas exocrinas, principalmente a las glándulas salivales y lagrimales, generando en los pacientes síntomas de sequedad bucal y ocular. La etiopatogenesis del SS es desconocida, la visión clásica de la patología se centra en la relación de los factores de predisposición (factores genéticos, neurohormonales, células inflamatorias) y factores extrínsecos (por ejemplo virus) que inducen una respuesta inmune. Sin embargo, la pérdida de la homeostasis de las células epiteliales también podría generar la activación del sistema inmune. Resultados previos demuestran que las células acinares de glándulas salivales labiales (GSL) de pacientes SS presentan alteraciones en su polaridad. Esta pérdida de polaridad afecta la localización de componentes de la maquinaria exocítica como las proteínas SNAREs (STX3, STX4, VAMP8). La correcta interacción entre las proteínas SNAREs de la membrana de gránulos de secreción y de la membrana plasmática permite su reconocimiento y fusión contribuyendo así, a la especificidad de las vías de tráfico de membranas. Estos antecedentes sugieren que la pérdida de polaridad también podría estar alterando otros componentes de la maquinaria exocítica, como son Sinaptotagmina-I (Syt-I) y la correcta señalización de Ca2+. La exocitosis y la señalización por Ca2+ son procesos altamente polarizados en las células acinares de las GS. La señal de Ca2+ es sensada por Syt-I, que sirve de nexo entre el estímulo y la maquinaria exocítica (proteínas SNAREs). El mecanismo a través del cual Syt-I ejerce su función moduladora, depende de su interacción con PIP2 (fosfatidil-inositol-4,5-difosfato), siendo un proceso polarizado y dependiente de Ca2+. PIP2 favorece la interacción de Syt-I con la membrana plasmática, permitiendo la exocitosis. Los antecedentes sobre Syt-I, PIP2 y Ca2+ en las células acinares de pacientes SS son escasos, por no decir inexistentes. Las células acinares de GSL de pacientes SS muestran una sobre-expresión significativa del mRNA de Syt-I en comparación a controles, esta última evaluada mediante microarreglos de cDNA. En relación a la señalización de Ca2+, la literatura reporta alteraciones en la regulación del volumen celular y una menor sensibilidad a la estimulación con acetilcolina en células acinares de pacientes SS. Cabe destacar que la mayoría de los estudios están dirigidos al transporte de agua y no consideran su participación en la secreción de los componentes proteicos de la saliva, en donde su rol junto a otros segundos mensajeros puede ser relevante. En base a estos antecedentes, se postuló la hipótesis de esta tesis: “En GSL de pacientes SS hay un aumento de la expresión de Syt-I y una alteración de su localización, que se acompaña de cambios en la polaridad celular y en la dinámica de distribución del Ca2+. Estas alteraciones determinan cambios en la capacidad exocítica”. Esto podría explicar en parte la hipofunción glandular. Para la validación de esta hipótesis, nuestro objetivo general fue: Determinar en glándulas salivales labiales (GSL) de pacientes SS y en un modelo de cultivo acinar de células derivadas de glándula submandibular humana (HSG: human submandibular gland cell line) cultivadas en 3 dimensiones (3D), alteraciones en componentes que participan en la exocitosis como son: Syt-I, PIP2 y Ca2+. Los objetivos específicos fueron: 1) En GSL de pacientes SS y controles: Determinar los niveles de mRNA y de proteína, la presencia de Syt-I en complejos SNAREs pre-existentes y la localización subcelular de Syt-I, y además, la localización polarizada de PIP2 en los dominios apicales y basales de la membrana plasmática de células acinares, 2) En cultivos 3D de células HSG: Caracterizar la señalización de Ca2+ y determinar la polaridad de los eventos exocíticos bajo la estimulación con agonistas colinérgicos y -adrenérgicos, y 3) evaluar el efecto de la sobre-expresión de Syt-I en la secreción. Nuestros resultados mostraron que Syt-I se encuentra sobre-expresada y forma parte de los complejos SNAREs preexistentes en las GSL de pacientes SS. Syt-I está presente en la región basolateral de las células acinares, donde mostró una parcial colocalización con STX4. PIP2 mostró una relocalización desde el polo apical hacia el polo basolateral en GSL de pacientes SS. La relocalización de PIP2 observada, fenómeno sumado a la presencia de complejos SNAREs en el dominio basolateral de pacientes SS, donde Syt-I se encuentra presente, podría explicar en parte, el fenómeno de exocitosis ectópica de mucinas observado en las GSL de pacientes SS. Por otro lado, los acinos originados por las células HSG cultivadas en 3D expresaron Syt-I, la cual presentó una distribución similar a la observada en GS. Estas células, al ser estimuladas con agonistas colinérgicos y adrenérgicos, generaron una señalización polarizada de Ca2+ y eventos exocíticos. Cabe destacar, que la señalización de Ca2+ y la generación de eventos exocíticos fueron dependientes, tanto del Ca2+ extracelular, como de la organización polarizada de los acinos. La sobre-expresión de Syt-I por sí sola no generó cambios en la polaridad ni en la cantidad de los eventos exocíticos, pero generó un incremento en la magnitud de estos eventos en el polo apical. Al incubar los acinos en cultivo con citoquinas pro-inflamatorias se indujo alteración en la polaridad, que en conjunto con la sobre-expresión de Syt-I, generaron un incremento en la magnitud y número de eventos exocíticos en el polo basal, reproduciendo el efecto que podrían tener estos factores en la inducción de exocitosis ectópica en las GSL de pacientes SS. Los resultados obtenidos nos permitieron concluir que: 1. Los pacientes SS muestran una respuesta exacerbada de la maquinaria exocítica en condiciones basales, lo cual se correlaciona con el aumento de los niveles de expresión de Syt-I encontrados; 2. La presencia de Syt-I en los complejos SNAREs en el dominio basolateral de células acinares de pacientes SS y la relocalización de PIP2, sugieren que estos complejos son funcionales y generan focos de exocitosis ectópica; 3. La presencia de mucinas en la matriz extracelular (MEC) de las GSL de pacientes SS, descrita previamente, sería el resultado de un proceso exocítico aberrante provocado por pérdida de polaridad y alteraciones en la señalización de Ca2+ y en la expresión y localización de componentes de la maquinaria exocítica, como las proteínas SNAREs, Syt-I y PIP2, entre otras; 4. Los acinos 3D al presentar similitudes respecto a la señalización de Ca2+ y la generación de eventos exocíticos a las células acinares de GS, nos permitirán evaluar los efectos de las alteraciones observadas en GSL de pacientes SS

Sjögren´s syndrome (SS) is a systemic autoimmune disease that affects exocrine glands, mainly lacrimal and salivary glands, causing mouth and eye dryness. SS etiopathogenesis is unknown; the classical approach has focused in the interplay between predisposing factors (genetic and neuro-hormonal factors and extrinsic factors such as viruses) and autoimmune response. However, the loss of glandular epithelial cell homeostasis might trigger immune system activation. We have demonstrated that acinar-cells of labial salivary glands (LSG) of primary SS-patients (pSS) show changes in cell polarity, leading to mislocalized components of the exocytic machinery, such as SNARE proteins (STX 3, STX 4, VAMP8). Changes of cell polarity could affect additional components involved in the exocytic process including synaptotagmin I (Syt-I), and Ca2+. Exocytosis and Ca2+ signaling are polarized processes in acinar-cells. Ca2+ signals are sensed by Synaptotagmin-I (Syt-I), a protein that may also act as a linker between Ca2+ stimulus and the exocytic machinery (SNARE proteins). The mechanism by which Syt-I achieves its modulatory function depends on its binding to phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2), which is Ca2+ dependent. PIP2 promotes an interaction between Syt-I and plasma membrane, allowing exocytocis. Previous antecedents on Syt-I, PIP2 and Ca2 + in acinar cells of SS-patients are scarce. Acinar-cells of LSG from SS-patients show a less sensitive Ca2+-response to acetylcholine stimulation and a significant upregulation of Syt-I mRNA. Most of the studies about Ca2+ signaling in salivary glands are focused in water mobilization and do not consider the cooperation of the protein components of saliva with the secretion process. According to the evidence above presented, the following hypothesis was postulated: In LSG from SS-patients there is high expression level of Syt-I and a change of its localization, which is accompanied by changes in cell polarity and Ca2+ signaling. Therefore, our main goal was to determine alteration in components involved in the exocytic process including Syt-I, PIP2 and Ca2+ signaling, both in LSG from SS-patients and in 3D HSG acini (HSG: human submandibular gland cell line). Specific aims were: 1) Determine Syt-I expression and localization as well as PIP2 localization. Moreover, determine if Syt-I is present in preformed fusion complexes in LSG of SS-patients compared to controls. 2) To evaluate Ca2+ signaling and exocytosis and as they are affected by changes of cell polarity in 3D HSG acini; 3. Evaluate the effect of Syt-I overexpression on exocytosis. Our results demonstrated that Syt-I is overexpressed in SS patients and is present in preformed fusion complexes. In addition, Syt-I is present in the basolateral pole of acinar cells, showing partial colocalization with the SNARE protein STX4. PIP2, a plasma membrane lipid with an essential role in exocytosis, was found to be relocated from the apical pole to the basal pole in LSG of SS-patients. PIP2 relocalization together with presence of SNARE complexes in the basolateral domain of SS patients where Syt-I is present, provide a partial explanation of the ectopic exocytic phenomena observed in acinar cells of SS patients. On the other hand, we demonstrated that the 3D acini of HSG cells is a culture model which adequately resembles the intracellular Ca2+ signaling and exocytic process occurring in acinar cells of salivary glands upon cholinergic and adrenergic agonist stimuli. Ca2+ signaling and exocytic events were dependent on extracellular Ca2+ and cell polarity. Moreover, our results showed that overexpression of Syt-I by itself did not generate changes of polarity of exocytic events, but generates an increase in the magnitude of exocytic events in the apical pole of 3D HSG cells. However, the synergy between altered polarity induced by preincubation with cytokines and the overexpression of Syt-I would be responsible for an increase in the magnitude and number of exocytic events at the basal pole of 3D HSG cells. In summary, results obtained in this thesis allow us to conclude that in LSG of SS patients: 1) There is an enhanced response at baseline exocytic machinery, which correlates with increased SYT-I expression levels found; 2) The presence of Syt-I in preformed fusion complexes SNARE at the basolateral domain and the relocation of PIP2, suggest that such complexes are functional and induce aberrant basolateral exocytosis; 3) The presence of mucins in ECM, previously described, could be the result of an aberrant exocytic process caused by changes of cell polarity, Ca2 + signaling and altered expression and localization of components involved in the exocytic process such as SNAREs, Syt-I and PIP2, among others; 4) 3D acini showing comparable Ca2+ signaling and exocytic events respect to LSG acinar cells, will allow us to evaluate the effects of alterations observed in LSG of SS patient