Niveles de RUNX2 en cáncer de ovario epitelial y efecto in vitro de los factores proangiogénicos NGF e hipoxia sobre sus niveles

Abstract

El cáncer ovárico epitelial (COE) es el cáncer ovárico más común, siendo en Chile la segunda causa de muerte por neoplasias ginecológicas. Un aspecto importante para la mantención y progresión tumoral es el establecimiento de nueva vasculatura. En COE, NGF y su receptor TRKA son mediadores directos de angiogénesis in vitro, e indirectos al inducir la expresión y secreción de VEGF. El factor transcripcional RUNX2 induce procesos oncogénicos como proliferación, migración e invasión celular. Adicionalmente, se cree que RUNX2 puede ser un mediador de angiogénesis tumoral, ya que en varios modelos de cáncer promueve la expresión de VEGF y sus niveles proteicos se incrementan en hipoxia. En COE, RUNX2 los niveles se relacionan con mal pronóstico y en modelos in vitro promueve proliferación, migración e invasión en células de cáncer ovárico, sin embargo, no existen estudios que busquen vincularlo con angiogénesis en este cáncer. Hipótesis: En cáncer ovárico epitelial se produce un aumento en los niveles de RUNX2, y en la línea celular A2780 de cáncer ovárico sus niveles son incrementados por los factores proangiogénicos NGF e hipoxia cuando se comparan con la línea celular HOSE de epitelio superficial ovárico normal. Objetivos: Establecer si RUNX2 se expresa en cáncer ovárico epitelial, si sus niveles se incrementan con la progresión de la transformación maligna del epitelio ovárico, y determinar si en el modelo de líneas celulares, RUNX2 es aumentado por las condiciones proangiogénicas de hipoxia y estímulo con NGF. Metodología: Se evaluaron los niveles proteicos de RUNX2 en tejidos ováricos (OVI, ovario normal inactivo; TBE-TBO, tumores ováricos Benignos y Borderline; y COE) mediante Western Blot, y a través de inmunohistoquímica se determinó el % células positivas con RUNX2 nuclear. En las líneas celulares HOSE y A2780 se evaluaron los niveles proteicos de RUNX2 en extractos totales y en fracciones subcelulares mediante Western Blot, y su localización subcelular mediante inmunocitoquímica. Adicionalmente, se realizaron estímulos con NGF, CoCl2 y ensayos de hipoxia en ambas líneas celulares, para posteriormente determinar los niveles proteicos de RUNX2 y HIF-1α por Western Blot. Resultados: Se determinó que los tejidos ováricos correspondientes a TBE-TBO y COE presentaron un mayor porcentaje de células positivas para RUNX2 nuclear respecto a lo observado en OVI. Por otro lado, ambas líneas celulares, HOSE y A2780, presentaron RUNX2 con localización principalmente nuclear, mostrando la línea HOSE niveles más altos respecto a la línea A2780. Los estímulos con NGF y CoCl2 no modificaron los niveles proteicos de RUNX2 en las líneas celulares en las condiciones analizadas. Por otra parte, se determinó que en la línea celular HOSE los niveles de RUNX2 disminuyen durante hipoxia, manteniéndose constantes los de HIF-1α. En el caso de las células A2780, no se observaron cambios en los niveles de las proteínas RUNX2 y HIF-1α en condiciones de hipoxia. Conclusiones: El presente trabajo permite concluir que los tejidos transformados de epitelio ovárico poseen un alto porcentaje de células con RUNX2 nuclear. Consistente con esto, la línea celular A2780 presenta altos niveles de RUNX2 en el núcleo, sugiriendo estos antecedentes un rol de RUNX2 en COE. Por otro lado, en las condiciones evaluadas, NGF e hipoxia no produjeron cambios en los niveles de RUNX2 en las líneas celulares. Proyección: Es necesario realizar nuevos ensayos para determinar con certeza si las condiciones proangiogénicas de NGF e hipoxia pueden inducir angiogénesis a través de RUNX2 en COE. En el caso de NGF es necesario evaluar si este puede influenciar la actividad transcripcional de RUNX2, y en el caso de hipoxia, se requiere modificar las condiciones experimentales para determinar con mayor seguridad si la restricción de oxígeno afecta los niveles de RUNX2

Epithelial ovarian cancer (COE) is the most common ovarian cancer, being Chile the second cause of death due to gynecological neoplasias. An important aspect for tumor maintenance and progression is the establishment of new vasculature. In COE, NGF and its TRKA receptor are direct mediators of in vitro angiogenesis, and indirectly by inducing VEGF expression and secretion. RUNX2 transcriptional factor induces oncogenic processes such as cell proliferation, migration and invasion. In addition, it is believed that RUNX2 may be a mediator of tumor angiogenesis, since in several cancer models it promotes the expression of VEGF and its protein levels increase in hypoxia. In COE, RUNX2 levels are related to poor prognosis and in vitro models promote proliferation, migration and invasion in ovarian cancer cells, however, there are no studies that seek to link it with angiogenesis in this cancer. Hypothesis: In epithelial ovarian cancer there is an increase in RUNX2 levels, and in the A2780 cell line of ovarian cancer their levels are increased by the proangiogenic factors NGF and hypoxia when compared to the HOSE cell line of normal ovarian surface epithelium. Objective: To establish whether RUNX2 is expressed in epithelial ovarian cancer, if its levels increase with the progression of malignant transformation of ovarian epithelium, and to determine if RUNX2 is increased in the cell lines model by the proangiogenic conditions of hypoxia and stimulation with NGF. Methods: RUNX2 protein levels in ovarian tissues (OVI, normal ovary, TBE-TBO, Benign ovarian tumors and Borderline, and COE) were evaluated by Western Blot, and by means of immunohistochemistry the percentage of RUNX2 nuclear positive cells was determined. In the HOSE and A2780 cell lines the protein levels of RUNX2 in total extracts and subcellular fractions were evaluated by Western Blot, and its subcellular localization by immunocytochemistry. Additionally, stimuli were performed with NGF, CoCl2 and hypoxia assays in both cell lines, to later determine the protein levels of RUNX2 and HIF-1α by Western Blot. Results: It was determined that the ovarian tissues corresponding to TBE-TBO and COE presented a higher percentage of RUNX2 nuclear positive cells than observed in OVI. On the other hand, both cell lines, HOSE and A2780, presented RUNX2 with mainly nuclear localization, showing the line HOSE levels higher than the line A2780. The stimuli with NGF and CoCl2 did not modify the protein levels of RUNX2 in the cell lines in the conditions analyzed. On the other hand, it was determined that in the HOSE cell line the levels of RUNX2 decrease during hypoxia, keeping those of HIF-1α constant. In the case of A2780 cells, no changes were observed in the levels of the RUNX2 and HIF-1α proteins under conditions of hypoxia. Conclusions: The present work concludes that the transformed tissues of ovarian epithelium possess a high percentage of cells with nuclear RUNX2. Consistent with this, the A2780 cell line presents high levels of RUNX2 in the nucleus, suggesting this background a RUNX2 role in COE. On the other hand, under the conditions evaluated, NGF and hypoxia did not produce changes in the RUNX2 levels in the cell lines. Projection: Further testing is required to determine with certainty whether the proangiogenic conditions of NGF and hypoxia may induce angiogenesis tHRPough RUNX2 in COE. In the case of NGF it is necessary to evaluate if this can influence the transcriptional activity of RUNX2, and in the case of hypoxia, it is necessary to modify the experimental conditions to determine more safely if the oxygen restriction affects RUNX2 levels