Desarrollo de un método molecular de monitoreo de levaduras vínicas en fermentaciones co-inoculadas

Abstract

La transformación del mosto de uva en vino, es un complejo proceso microbiológico realizado principalmente por levaduras del género Saccharomyces, responsables de la fermentación alcohólica. Actualmente, las co-inoculaciones con levaduras comerciales no Saccharomyces (Torulaspora delbrueckii) y Saccharomyces cerevisiae, son una alternativa para la incorporación de enzimas β-glucosidasas, pectinasas y proteasas al mosto. El mosto alberga una diversa microbiota inicial; esta heterogeneidad microbiológica dificulta el control del proceso fermentativo. Por ello, se desarrolló un método de monitoreo de levaduras vínicas en fermentaciones de co-inoculación, aplicando métodos de taxonomía molecular. Se analizaron las regiones ribosomales, sobre las cuales se diseñó una estrategia “in silico”, mediante perfiles de restricción (RFLP), empleando endonucleasas específicas; lográndose una fácil y fidedigna diferenciación de los microorganismos involucrados. De manera experimental se trabajó con un mosto del cultivar Syrah; que se separó en dos cubas, una fue inoculada únicamente con Saccharomyces cerevisiae y otra fue co-inoculada con Torulaspora delbrueckii y Saccharomyces cerevisiae. Se examinaron distintas etapas del proceso de fermentación, logrando en todos los casos extraer ADN de forma directa desde las muestras de vino en una aproximación independiente de cultivo. El ADN extraído fue sujeto a un proceso de PCR para amplificar la región ITS 5.8S. Estos amplicones se sometieron a digestión con las enzimas AluI, ApaI, HaeIII, SphI, lo que permitió definir e identificar la presencia de las levaduras involucradas en cada fase de la fermentación alcohólica. Todo esto permitió demostrar que la variación genética de las regiones ribosomales, permite la diferenciación a través de métodos moleculares, de las levaduras vínicas: Saccharomyces cerevisiae y Torulaspora delbrueckii, comúnmente usadas en co-inoculación.

Transformation of grape must into wine is a complex microbiological process done mainly by Saccharomyces yeasts, responsible for the alcoholic fermentation. Currently, co-inoculated with Saccharomyces commercial yeasts (Torulaspora delbrueckii) and Saccharomyces cerevisiae, are an alternative to the incorporation of β-glucosidase enzymes, pectinase and protease to the must. The must has a diverse microbiota initial, this heterogeneity hinders this fermentation process control. Therefore, we developed a method of monitoring fermentations wine yeasts in co-inoculation, using methods of molecular taxonomy. Ribosomal regions were analyzed, over which strategy was designed “in silico” by restriction profiles (RFLP) using specific endonucleases; achieving an easy and accurate differentiation of the microorganisms involved. Experimentally we worked with Syrah grape cultivar, which split into two tanks, one was inoculated with Saccharomyces cerevisiae and other was co-inoculated with Torulaspora delbrueckii and Saccharomyces cerevisiae. We examined various stages of the fermentation process, obtaining in all cases extract DNA directly from the wine samples in a culture-independent approach. The extracted DNA was subjected to a process of PCR to amplify the region ITS 5.8 S. These amplicons were digested with the enzyme AluI, ApaI, HaeIII, SphI, allowing define and identify the presence of yeast involved in each stage of the fermentation. All this helped to show that the genetic variation of ribosomal regions, allows differentiation through molecular methods of wine yeasts: Saccharomyces cerevisiae and Torulaspora delbrueckii, commonly used in co-inoculation.