Purificación y caracterización de una nueva lacasa aislada del microorganismo termófilo antártico geobacillus SP. ID17

Abstract

Las lacasas son enzimas de la familia de las multi-cobre oxidasas que han suscitado mucho interés debido a su amplia especificidad de sustrato, la variabilidad de sus propiedades entre cada especie, y su todavía elusivo mecanismo de reacción. La presencia de cuatro centros de cobre en su sitio activo la convierte en un modelo interesante para el estudio de la relación entre la estructura y la función de proteínas. Estos átomos de cobre son además responsables de las propiedades catalíticas de las lacasas y exhiben propiedades redox y espectroscópicas que son propias de estas enzimas. Es posible encontrarlas en hongos, plantas y en procariontes. Las lacasas bacterianas poseen muchas ventajas desde el punto de vista aplicado por sobre las lacasas de hongos, que hasta hoy se encuentran mejor caracterizadas. En general poseen una mayor termoestabilidad, y exhiben un perfil de pH distinto, lo que permite ampliar el número de aplicaciones de estas enzimas. Sus propiedades las hacen buenas candidatas para diversas aplicaciones biotecnológicas, que van desde la industria textil hasta la industria de alimentos, e incluyen su aplicación como biosensores, su uso en bioremediación de suelos y aguas entre otros. En este trabajo se caracteriza una lacasa recientemente detectada en el microorganismo termófilo antártico Geobacillus sp. ID17. Esta es la primera lacasa caracterizada de una bacteria antártica, y la primera lacasa intracelular descrita de este género bacteriano. La purificación de la enzima se logró utilizando cromatografía de intercambio aniónico y exclusión molecular. Luego de obtener una muestra pura se determinaron sus propiedades bioquímicas y su rango de sustratos. La lacasa purificada demostró poseer una alta estabilidad térmica a pH neutro y 55 ºC. Se detectó la mayor actividad enzimática en el rango entre 55 y 60 ºC, a pH 7,5. Además la enzima posee una mayor selectividad de sustrato que otras lacasas descritas a la fecha. Adicionalmente, se describe la purificación parcial de una segunda enzima presente en el extracto crudo del Geobacillus sp. ID17, que demostró poseer una actividad peroxidasa dependiente de cobre

Laccases are enzymes from the Multi-Copper Oxidase family that have gathered high attention due to their wide range of substrates, their interspecies variability and their still elusive mechanism of action. The presence of four copper atoms in their active site makes them an interesting model for the study of the relationship between the structure and function of proteins. These copper atoms are responsible for the catalytic properties of laccases and exhibit redox and spectroscopic features unique to this class of enzymes. It is possible to find them in fungi, plants, and prokaryotes. Bacterial laccases display many advantages over fungal laccases for their application. They have, in general, a higher thermal stability and a different pH profile, which contributes to widen the possible application of laccases. In this thesis a new laccase from an Antarctic microorganism, Geobacillus sp. ID17, is purified and characterized. This is the first Antarctic bacterial laccase to be functionally described, and the first intracellular laccase from this bacterial genus. The pH profile, catalytic constants, and thermal behavior of the enzyme is described. A screening of different laccase substrates reveals that this new laccase has different substrate specificity than the commercial laccase from Trametes versicolor. The enzyme was purified using anionic exchange and size-exclusion chromatography. After obtaining a pure enzyme, its biochemical parameters and substrate specificity were determined. The purified laccase showed high thermal stability at neutral pH and 55 ºC. The highest activity was detected between 55 ºC and 60 ºC, at pH 7,5. Additionally, this enzyme shows higher substrate selectivity than other previously described laccases. Additionally, the partial purification of a second enzyme present in the crude extract of Geobacillus sp. ID17, which seems to display a copper dependent peroxidase activity, is described