Modificación de nanobarras de oro para aumentar la llegada al cerebro

Abstract

Las nanobarras de oro son nanomateriales muy interesantes para su uso en la terapia de diferentes patologías como cáncer o la enfermedad de Alzheimer, ya que poseen la capacidad de absorber gran cantidad de energía en la región del infrarrojo cercano, en la cual los tejidos biológicos son transparentes a la radiación, y disiparla en forma de calor. No obstante para una eventual terapia, estos nanomateriales deben llegar a su blanco terapéutico que en el caso de la enfermedad de Alzheimer son los agregados tóxicos de la proteína β amiloide presentes en el cerebro. Uno de los grandes desafíos de la nanomedicina para la terapia de enfermedades neurodegenerativas es el de lograr que los nanomateriales lleguen al sistema nervioso central. Para estos propósitos, en esta tesis se multifuncionalizaron las Nanobarras de oro con el péptido Angiopep-2, que se utiliza como lanzadera de fármacos para favorecer el paso a través de la barrera hematoencefálica, y además con el péptido qshyrhispaqv (D1), el cual posee una afinidad en el rango sub-micromolar in vitro por los agregados del péptido β amiloide. Asimismo, las NR se conjugaron con dos tipos de polietilenglicol: Metoxi-Polietilenglicol tiolado que evita las interacciones inespecíficas, y Carboxi-Polietilenglicol tiolado que contiene un grupo carboxílico que permite la unión con un grupo amino terminal correspondiente a los péptidos, empleando agentes acoplantes. Las nanopartículas obtenidas fueron caracterizadas por Microscopia Electrónica de Transmisión, Espectrofotometría UV-Visible, Potencial Zeta y Dispersión Dinámica de la luz. Adicionalmente fue evaluada la citotoxicidad, estabilidad y la penetración in vitro de Nanobarras modificadas en células endoteliales microvasculares de rata bEnd.3 y RBEMC, observándose la capacidad de ingresar al medio intracelular. La capacidad de las Nanobarras modificadas de reconocer fibras de péptido β amiloide fue ensayada mediante una incubación con dichas fibras, y su posterior visualización por Microscopía electrónica de Transmisión. Por otra parte, se observó en cerebro de rata ex vivo la llegada al cerebro por fluorescencia, y se comprobó mediante cuantificación de oro. Como resultado de esta tesis se puede concluir que el conjugado propuesto de Nanobarras de oro modificadas con los péptidos Angiopep-2 y D1, no presenta toxicidad celular, y además es capaz de llegar al cerebro en mayor proporción que su control, que corresponde a Nanobarras de oro no modificadas. Además, en ensayos in vitro se confirmó la capacidad de reconocer agregados de fibras de péptido β-amiloide. De esta forma se espera poder contribuir al desarrollo de una estrategia para mejorar la llegada de las nanopartículas de oro al Sistema Nervioso Central, lo que representará un gran avance para una posible terapia de la enfermedad de Alzheimer

Gold Nanorods are very interesting nanomaterials for use in the therapy of different pathologies such as cancer or Alzheimer's disease, since they have the capacity to absorb large amounts of energy and to dissipate it in the form of heat in the near infrared region, in which biological tissues are transparent to radiation. However for a possible therapy, these nanomaterials must reach their therapeutic target, which in the case of Alzheimer's disease are the toxic aggregates of the β amyloid protein present in the brain. One of the bigger challenges of nanomedicine for neurodegenerative disease therapy is that nanomaterials reach the central nervous system. For this purpose, Gold Nanorods were multifunctionalized with the peptide Angiopep-2, which is used as a drug shuttle to promote passage through the blood-brain barrier, and also with the peptide qshyrhispaqv (D1), which has an affinity in the sub-micromolar range in vitro by the amyloid aggregates. Also, the Gold Nanorods were conjugated to two types of polyethylene glycol: thiolated Metoxy-Polyethylene glycol avoiding non-specific interactions, and Carboxy-Polyethylene glycol containing a carboxylic group which allows attachment to a terminal amino group corresponding to the peptides using coupling agents. The nanoparticles obtained were characterized by Transmission Electron Microscopy, UV-Visible Spectrophotometry, Zeta Potential and Dynamic Light Scattering. In addition, cytotoxicity, stability and in vitro penetration in microvascular endothelial cells of rat bEnd.3 and RBMVEC were evaluated, and the capacity to enter the intracellular medium was observed. The ability of the multifunctionalized Gold Nanorods to recognize β amyloid peptide fibers were assayed by incubation with said peptide and visualization by Transmission Electron Microscopy. On the other hand, the arrival to the brain was observed ex vivo by fluorescence, and was checked by quantification of gold. As a result of this thesis it can be concluded that the proposed conjugate does not present cytotoxicity, and is also able to reach the brain in a greater proportion than its control. In addition, the ability to recognize aggregates of β amyloid peptide fibers was confirmed in in vitro assays. In this way it is hoped to contribute to the development of a strategy to improve the arrival of gold nanoparticles to the Central Nervous System, which will represent a great advance for a possible therapy of Alzheimer's disease