Participación de CREB en la señalización antiapoptótica del IGF-1 en cardiomiocitos expuestos a estrés hiperosmótico

Abstract

Las enfermedades cardiovasculares son la primera causa de muerte en todos los países desarrollados, incluyendo Chile. En los últimos años se ha sugerido que la pérdida de cardiomiocitos debido a muerte celular es un factor importante en el desarrollo de la insuficiencia cardiaca. Sin embargo, no existe claridad acerca del mecanismo por el cual se produce la muerte de los cardiomiocitos y de su desaparición del tejido cardiaco. En el corazón se produce estrés hiperosmótico durante eventos de isquemia/reperfusión cardiaca. Existe un pobre conocimiento acerca de las vías de señalización cardiaca que conllevan a la muerte celular como una consecuencia del estrés osmótico. Nosotros hemos demostrado que el estrés hiperosmótico (sorbitol 600 mOsm) induce una rápida apoptosis en cardiomiocitos en cultivo. El futuro desarrollo de esta área requiere la identificación de moléculas que protejan a los cardiomiocitos de la muerte celular. En este aspecto, el agente más promisorio corresponde al factor de crecimiento análogo a insulina tipo 1 (IGF-1). Algunas células poseen eficientes mecanismos reguladores involucrados en la mantención de la homeostasis, sin embargo el cardiomiocito es especialmente vulnerable a la apoptosis inducida por estrés hiperosmótico debido a que regula su volumen muy lentamente. Aunque existe cierta caracterización molecular de los eventos desencadenados en la apoptosis inducida por sorbitol, se desconoce la participación del Ca2+ y de factores transcripcionales en este proceso. El propósito de esta tesis fue estudiar los mecanismos de señalización que regulan la apoptosis del cardiomiocito inducida por estrés hiperosmótico. Con este objetivo, se estudió la actividad y regulación transduccional del factor transcripcional CREB en respuesta a IGF-1 y/o estrés hiperosmótico. CREB es un importante mediador de la sobrevida celular promovida por IGF-1 en otros tipos celulares. Por lo tanto se investigó la participación de CREB en la señalización antiapoptótica gatillada por IGF-1 en este modelo de estrés hiperosmótico. Además, se estudiaron los efectos del estrés hiperosmótico en cultivos primarios de cardiomiocitos, en términos de cambios en los niveles intracelulares de Ca2+ y en las actividades enzimáticas de la proteína kinasa dependiente de Ca2+/CaM (Calmodulina quinasa II, CaMKII) y la proteína fosfatasa Calcineurina (Cn). Los resultados presentados en este estudio demostraron que tanto el estrés hiperosmótico como IGF-1 conllevan a la activación de CREB, a través de su fosforilación, aunque probablemente por vías distintas. La activación de CREB por estrés hiperosmótico dependió de Ca2+ i y las vías MAPK, ya que BAPTA-AM e inhibidores de las vías p38-MAPK y ERK impidieron el aumento de su fosforilación. Por otro lado, la preincubación de cardiomiocitos con BAPTA-AM o inhibidores de las vías p38-MAPK, ERK, PI3-K, Cn and CaMKII disminuyeron significativamente la fosforilación de CREB inducida por IGF-1. El estrés hiperosmótico bloqueó la activación de CREB inducida por IGF-1, con un patrón de activación similar al de el estímulo apoptótico. Finalmente, los resultados indicaron que CREB participa en la señalización antiapoptótica del IGF-1 en cardiomiocitos expuestos a estrés hiperosmótico, pero no en la respuesta de sobrevida celular frente al estímulo osmótico. El efecto protector de IGF-1 frente a estrés hiperosmótico fue bloqueado por la expresión de una forma inactiva de CREB, como se demuestra con la mayoría de los parámetros apoptóticos evaluados en este estudio; sin embargo, la apoptosis inducida con este modelo experimental no presentó cambios significativos tras la sobreexpresión de CREB inactivo. Los resultados, además, demostraron que el estrés hiperosmótico llevó a aumentos rápidos y transitorios de los niveles de Ca2+ i, como resultado tanto del influjo de este ión desde el medio extracelular como de su liberación desde depósitos intracelulares. Este aumento del Ca2+ i estuvo mediado al menos, por entrada de Ca2+ por canales de Ca2+ de tipo L y la liberación desde reservorios de Ca2+ activada por IP3. Los resultados también mostraron que la liberación de Ca2+ desde depósitos intracelulares inducida por el estrés hiperosmótico depende de la activación de Fosfolipasa C (PLC). El estrés hiperosmótico no produjo un aumento de las actividades enzimáticas CaMKII y Cn. El pretratamiento de los cardiomiocitos con KN62 (inhibidor de CaMKII) y CsA (inhibidor de Cn) no modificó significativamente la apoptosis inducida por estrés hiperosmótico, evaluada en términos de viabilidad celular, fragmentación del DNA, activación de caspasa-3 y -9 y externalización de fosfatidilserina. Estos resultados sugieren que dichas vías de señalización probablemente no estarían involucradas en la regulación de la apoptosis desencadenada por el estrés hiperosmótico inducido por sorbitol. De este trabajo de tesis se puede concluir que: 1) CREB participaría en la señalización antiapoptótica del IGF-1 en cardiomiocitos expuestos a estrés hiperosmótico, pero no en la muerte inducida por este tipo de estrés; 2) el estrés hiperosmótico produce un aumento de los niveles Ca2+ i como consecuencia del influjo de este ión desde el medio extracelular y de su liberación desde depósitos intracelulares; y finalmente, 3) CaMKII y Cn no participarían en la apoptosis inducida por el estímulo osmótico

Cardiovascular diseases are the leading cause of death in all developed countries, including Chile. In recent years, it has been suggested that loss of cardiomyocytes due to cell death is an important causative factor in the development of heart failure. However, the mechanism by which cardiomyocytes die and then disappear from the tissue is not clear. In the heart, osmotic stress occurs during myocardial ischemia/reperfusion. Cardiac signaling pathways leading to cell death as a consequence of osmotic stress remain poorly understood. We have shown that hyperosmotic stress (sorbitol 600 mOsm) rapidly induces apoptosis in cultured cardiomyocytes. Future development in this area will require the identification of molecules that protect cardiac cells from cell death. The most promising agent is insulin like growth factor-1 (IGF-1). Several cells display efficient regulatory mechanisms involved in maintaining homeostasis, however cardiomyocyte is especially vulnerable to hyperosmotic stress-induced apoptosis since its volume is regulated very slowly. Although there is some molecular characterization of the events engaged in estrés hiperosmótico-induced apoptosis, the involvement of Ca2+ and transcription factors remains unknown. The aim of this thesis was to study of the signaling mechanisms regulating hyperosmotic stress-induced apoptosis of cardiomyocyte. With that purpose, the activity and transductional regulation of transcriptional factor CREB in the response to IGF-1 and/or hyperosmotic stress were studied. Since CREB is an important mediator of IGF-1 promotion of cell survival in other cell types, the participation of CREB in the IGF-1-induced antiapoptotic signaling pathway during hyperosmotic stress was also investigated. In addition effects of sorbitolinduced hyperosmotic stress on primary cardiomyocyte cultures were studied, in terms of changes in Ca2+ intracellular levels, Ca2+/CaM-dependent protein kinase (Calmodulin kinase II, CaMKII) and the protein phosphatase Calcineurin (Cn) enzymatic activities. Data presented in this study showed that CREB activation (phosphorilation) was induced by both hyperosmotic stress and IGF-1, although most likely by different pathways. CREB activation by hyperosmotic stress depended on Ca2+ i and MAPK pathways since BAPTA-AM and p38-MAPK and ERK pathway inhibitors prevented its phosphorylation. In the other hand, pretreatment of cardiomyocytes with BAPTA-AM or p38-MAPK, ERK, PI3-K, Cn and CaMKII pathway inhibitors significantly decreased CREB phosphorylation induced by IGF-1. Hyperosmotic stress prevented CREB activation IGF-1-induced, maintaining the activation pattern of DNA affinity displayed after the apoptotic stimulus. Finally, the results indicated that CREB participates in the IGF-1 antiapoptotic signaling in cardiomyocytes treated with hyperosmotic stress, but not in the cell survival response. The protective effect of IGF-1 towards sorbitol was overridden by the overexpression of an inactive form of CREB, as shown by most of the apoptotic parameters evaluated in this study; however, stress-induced apoptosis with this experimental model remained unchanged by overexpression of inactive CREB. The results also showed that hyperosmotic stress led to fast and transient increases in intracellular Ca2+ levels, which were the result of both Ca2+ influx from the extracellular milieu and the release from intracellular stores. This Ca2+ i increase was mediated in part by Ca2+ inward by L-type Ca2+ channels and release from stores by IP3 receptors. Results also showed that hyperosmotic stress-induced Ca2+ release from intracellular stores was also dependent on PLC activation. Hyperosmotic stress did not induce CaMKII and Cn enzymatic activities. Pretreatment of cardiomyocytes with KN62 (CaMKII inhibitor) and CsA (Cn inhibitor) did not modified significantly hyperosmotic stress-induced apoptosis, evaluated in terms of cell viability, DNA fragmentation, caspases–3 and –9 activation and phosphatidylserine externalization. These results suggested that these two signaling pathways were not likely implicated in the regulation of apoptosis triggered by sorbitol-induced hyperosmotic stress. Conclusions drawn from this thesis work are: 1) CREB most likely is involved in IGF-1 antiapoptotic signal in cardiomyocytes subjected to hyperosmotic stress but not in this type of stress-induced cell death; 2) hyperosmotic stress leads to an increase in intracellular Ca2+ levels due to both influx from the extracellular milieu and release from intracellular stores; and finally, 3) CaMKII and Cn are not likely to be involved in this osmotic stimulus-induced apoptosis