Estudio de la regulación de la vía esteroidogénica intestinal y su caracterización en pacientes con colitis ulcerosa

Abstract

Las enfermedades inflamatorias del intestino (EII) son condiciones de inflamación crónica del tracto gastrointestinal y abarca dos manifestaciones clínicas principales: Enfermedad de Crohn (EC) y Colitis Ulcerosa (CU). En Chile no se cuenta con información epidemiológica exacta de cifras de prevalencia o incidencia, sin embargo, estudios uni- y multicéntricos han demostrado el constante aumento de la incidencia de EII, atribuible principalmente a la CU. La CU es una enfermedad inflamatoria crónica idiopática, para la que aún no existe un tratamiento curativo definitivo, caracterizada por etapas de actividad (comúnmente con sangrado en las deposiciones y diarreas recurrentes) e inactividad/remisión. Los glucocorticoides (GC), son el tratamiento base y de primera línea en CU puesto que, debido a su acción anti-inflamatoria e inmunomoduladora, son altamente efectivos en la inducción de la remisión clínica y endoscópica. Sin embargo, a pesar que más de la mitad de los pacientes con EII responden al tratamiento con GC, el 19% son refractarios o resistentes al tratamiento y el 20% de los pacientes sometidos a terapia prolongada con GC, se hacen dependientes del fármaco. Numerosas vías han sido propuestas para explicar los efectos anti-inflamatorios e inmunomodulatorios de los GCs exógenos una vez que se unen al receptor de glucocorticoides (GR). Adicionalmente, estudios más recientes han identificado al epitelio intestinal como una importante fuente de GCs endógenos extra-adrenales, los que no son regulados por la actividad del eje HPA (ni afectarían la producción sistémica de GCs), sin embargo, con capacidad de ejercer sus efectos localmente. Esta esteroidogénesis intestinal representaría un mecanismo fundamental para la mantención de la homeostasis y estaría, por lo tanto, adaptado y sujeto a las necesidades locales, presentándose como un importante mecanismo inmuno-regulatorio tejido-específico. Además, la producción de GCs es inducida por estimulación de las células inmunes y el microambiente inflamatorio característico de la CU. En particular, la vía enzimática de síntesis de cortisol (a partir de colesterol) parece ser idéntica a la operante en la glándula adrenal, pero regulada por moléculas y eventos de señalización diferentes. Así, la actividad del factor transcripcional Liver receptor homologue 1 (LRH-1) ha cobrado especial relevancia para comprender en profundidad el mecanismo de regulación de las enzimas esteroidogénicas (CYP11A1 y CYP11B1), corroborando una elevada expresión a nivel del epitelio intestinal. xv En base a los antecedentes expuestos, la hipótesis propuesta en esta tesis es: Los glucocorticoides inducen la expresión de LRH-1 y la activación de la vía esteroidogénica intestinal. Así, el desarrollo de esta investigación pretendió determinar el efecto de los GCs sobre la expresión de LRH-1 y la activación de la vía esteroidogénica intestinal, y, en este contexto, caracterizar sus componentes en la mucosa intestinal de pacientes con CU y la posible relación con la respuesta a la terapia corticoidal. Para esto, en primer lugar, se caracterizó de la expresión de los transcritos de los componentes de la vía esteroidogénica propuesta en la mucosa intestinal de pacientes con CU y la capacidad productora de cortisol inducida por GCs fue determinada mediante qPCR y ELISA, respectivamente. Los ensayos ex vivo mostraron que la mucosa intestinal (tanto de individuos sanos como de pacientes con CU) produce cortisol al ser estimulada con GCs exógenos y esta capacidad esteroidogénica es regulada tanto por GR como por el factor LRH-1. Adicionalmente, los resultados obtenidos sugieren de diferencias a nivel de la expresión estos componentes de la vía esteroidogénica entre la mucosa intestinal de pacientes que respondieron adecuadamente a la terapia con GCs y aquellos que no. Una menor expresión de LRH-1 y GR total en la mucosa de pacientes refractarios y dependientes comparado con respondedores, sugieren que la expresión de estos componentes está relacionada con la respuesta a la terapia con GCs. Sumado a lo anterior, estudios realizados mediante índice de correlación de Pearson, arrojaron una correlación positiva entre la expresión de GR y LRH-1 en la mucosa intestinal de los sujetos de estudio. Para determinar la regulación directa de la expresión del LRH-1 y activación de la vía esteroidogénica mediante GCs/GR, un modelo de línea celular intestinal epitelial de colon humano (Ccd841CoN) fue utilizado. La producción de cortisol y la inducción de los componentes de la vía esteroidogénica mediada por GCs fue evaluada por ELISA, qPCR y Western Blot. Por último, la regulación directa de LRH-1 por GCs/GR fue estudiada por ChIP-qPCR. Los resultados obtenidos permiten confirmar la inducción del factor regulador principal de la vía esteroidogénica intestinal, LRH-1, mediada por GCs tanto a nivel de transcrito como de proteína y, además, relacionar por primera vez la actividad de LRH-1 y la xvi producción de cortisol endógeno en el epitelio intestinal con la actividad del GR como factor transcripcional que induciría la transactivación y expresión de LRH-1 por unión directa a sitios GRE en su promotor. A partir de los resultados obtenidos, esta tesis propone que los GCs exógenos son capaces de regular transcripcionalmente al factor LRH-1 por unión directa de GR a los sitios GRE en su promotor. La expresión y el efecto regulatorio de LRH-1 desencadenaría la producción a nivel intestinal de GCs endógenos en las células epiteliales del colon. Una vez en la mucosa, el cortisol producido ejercería su actividad inmunomoduladora y anti-inflamatoria de manera local. Estos hallazgos permiten concluir que el funcionamiento de la vía esteroidogénica podría controlar la progresión de patologías inflamatorias autoinmunes como la CU y que alteraciones en la misma podrían explicar una respuesta alterada a la terapia con corticoides en estos pacientes

Study of the regulation of the intestinal steroidogenic pathway and its characterization in intestinal mucosa of ulcerative colitis patients The inflammatory bowel diseases (IBD) represent chronic inflammatory conditions of the gastrointestinal tract and include two main clinical manifestations: Crohn´s Disease (CD) and Ulcerative Colitis (UC). In Chile, there is no epidemiologic data relating to the prevalence or incidence rates, however, uni- and multicenter studies have demonstrated a constant increase in IBD incidence, which is mainly due to a concomitant increase of UC cases. UC is an idiopathic chronic inflammatory disease, for which there is no definitive curative treatment available. This pathology is characterized by activity stages, (commonly manifested with bleeding on the stool and recurrent diarrhea), and also inactive stages or remission. The glucocorticoids (GC) are the fist-line treatment for UC patients since, due to their anti-inflammatory and immunomodulating action, they are highly effective in inducing clinical and endoscopic remission. However, it is important to mention that although more than half of IBD patients respond to GC treatment, 19% are refractory or resistant to the treatment and 20% of patients undergoing a prolonged GC therapy, become drug dependent. Numerous ways in which exogenous GCs linked to the glucocorticoid receptor (GR) would exert their anti-inflammatory and immunomodulatory effects have been proposed. Additionally, more recent studies have identified the intestinal epithelium as an important source of extra-adrenal endogenous GCs, which are not regulated or affected by the HPA axis nor would affect the systemic GCs production, and are able to exert local effects. This would represent an important mechanism for intestinal homeostasis maintenance and would, therefore, be adapted to the local needs, presenting itself as an important tissue-specific immunoregulator. It has also been reported that GCs production is induced by stimulation of immune cells and by the inflammatory microenvironment characteristic of inflammatory pathologies such as UC. In addition, while the enzymatic pathway of cortisol synthesis from cholesterol appears to be identical to that studied in the adrenal gland, it would be xviii regulated by different molecules and signaling events. Thus, the activity of the transcriptional factor LRH-1 has gained special scientific relevance to understand the regulatory mechanism of steroidogenic enzymes CYP11A1 and CYP11B1, and has been corroborated by a high intestinal expression of this factor. Based on the above, the hypothesis proposed in this thesis is: Glucocorticoids induce the expression of LRH1 and the activation of the intestinal steroidogenic pathway. Thus, the development of this research aims to determine GCs effect on LRH-1 expression and the intestinal steroidogenic pathway activation, and, in this context, characterize the expression of the components of this pathway in the intestinal mucosa of UC patients whilst studying the possible relationship with the response to therapy with GCs. Initially, transcript expression of steroidogenic pathway components and the cortisol-producing capacity induced by GCs was characterized in the intestinal mucosa of UC patients by qPCR and ELISA, respectively. These ex vivo trials demonstrated the intestinal mucosa of both healthy individuals and UC patients is capable of producing cortisol when stimulated with exogenous GCs and that this steroidogenic capacity is regulated both by the GR and LRH-1. Alternatively, these results suggest differences at the expression level of these regulatory components between the intestinal mucosa of patients who responded adequately to GC therapy and those who did not. In general, lower expression of LRH-1 and total GR in the mucosa of refractory and dependent patients compared to responders, suggest that the component expression is related to the response to GC therapy. In addition to the above, Pearson data analysis showed a significant positive correlation between GR and LRH-1 expression in the intestinal mucosa of the study subjects. To determine the direct LRH-1 expression regulation and activation of steroidogenic pathway by GCs / GR, a human colon epithelial intestinal cell line model (Ccd841CoN) was used and cortisol was quantified by ELISA. Additionally, the induction of the steroidogenic pathway components mediated by GCs was evaluated by qPCR and Western Blot and finally, the direct regulation of LRH-1 by GCs / GR was studied by ChIP-qPCR. The results obtained confirm the induction of LRH-1, mediated by GCs both at the level of transcript and protein. Also, the results make it possible for the first time to relate the LRH-1 activity and endogenous cortisol production in the intestinal epithelium with the activity of GR as a transcriptional factor that would transactivate LRH-1gene by directly xix binding to GRE sites in its promoter, thus inducing its expression at the level of mRNA and protein. The expression and regulatory effect of LRH-1 would trigger the intestinal production of endogenous GCs in the epithelial cells of the colon, and once in the mucosa, the cortisol produced will exert its immunomodulatory and anti-inflammatory activity. We therefore conclude that the functioning of this pathway could control the progression of autoimmune inflammatory diseases such as UC, and that alterations in it could explain a failed response to GCs therapy in these patients