Nanopartículas de oro multifuncionalizadas: su interacción con membranas fosfolipídicas y sus efectos sobre la viabilidad celular”

Abstract

Nanopartículas de oro multifuncionalizadas: Su interacción con membranas fosfolipídicas y sus efectos sobre la viabilidad celular. Las nanopartículas de oro (NPAu) han sido ampliamente utilizadas en el tratamiento de diferentes patologías como cáncer o enfermedades neurodegenerativas, ya que poseen distintas propiedades físicas y químicas, como una alta área superficial, el efecto de permeación y retención (EPR), y la resonancia plasmónica de superficie (SPR), entre otras. Dentro de las enfermedades neurodegenerativas, la enfermedad de Alzheimer (EA) es una de las más relevantes, siendo su principal blanco terapéutico los agregados tóxicos de la proteína β-amiloide (ATAβ). Es por esto, que se busca llegar a estos ATAβ y disgregarlos localmente a través del uso de NPAu mediante su capacidad de absorber grandes cantidades de energía y disiparlas en forma de calor, sin producir daño del tejido biológico. Estudios de biodistribución realizados in vivo en nuestro laboratorio demostraron que NPAu funcionalizadas con el péptido CLPFFD que reconoce a los ATAβ, llegan al cerebro en una proporción muy baja en relación a la dosis inyectada (aproximadamente 0,05%), ya que quedan retenidas en el hígado y bazo posiblemente debido a su interacción con células del sistema retículo endotelial. Es por esto, que se hace imprescindible aumentar la biodisponibilidad de las NPAu para aumentar su llegada al cerebro. Para este propósito, nanopartículas esféricas de oro (NPAu-e) fueron xvi multifuncionalizadas con polietilenglicol (PEG) y ciclodextrinas aminadas (CD-NH2), con el fin de obtener un nanosistema que penetre en modelos de membrana y que no poseyera efectos sobre la viabilidad celular. Las NPAu-e fueron funcionalizadas con dos tipos de PEG; el HS-PEG-OMe, el cual evita interacciones inespecíficas y el HS-PEG-COOH, el cual posee un grupo carboxílico que permite la unión con el grupo amino terminal de CD-NH2 empleando la reacción1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida/N-hidroxisuccimida (EDC/NHS). Las NPAu-es obtenidas fueron caracterizadas por dispersión dinámica de la luz (DLS), potencial Zeta, espectroscopía de fotoelectrones generados por rayos X (XPS) y microscopía electrónica de transmisión (TEM), observándose cambios en los parámetros fisicoquímicos que dan cuenta de la multifuncionalización de los nanosistemas. Además, se evaluó la estabilidad de los conjugados en el tiempo (7 días), a distintos pHs (3, 7, 9) y al cambiar la fuerza iónica (150 mM de NaCl) realizando variaciones en la proporción HS-PEG-OMe/HS-PEG-COOH, obteniéndose una proporción óptima. Se determinó mediante el ensayo de fluorescencia con fluorescamina el grado de funcionalización de las nanopartículas con CD-NH2. Utilizando el ensayo in vitro de permeabilidad de membrana artificial en paralelo (PAMPA) y ensayos de penetración celular con la línea celular de neuroblastoma SH-SY5Y, se determinó si los cambios en las propiedades fisicoquímicas y la incorporación de CDs aumentan la permeabilidad de los conjugados a través de membranas. Además, mediante los ensayos de viabilidad celular MTS y LDH, xvii se evaluó si los nanosistemas utilizados durante esta tesis tenían efectos citotóxicos en la línea celular de neuroblastoma SH-SY5Y debido a los cambios en sus propiedades fisicoquímicas. Los resultados obtenidos dan cuenta de que se obtuvo un sistema estable bajo las condiciones estudiadas (tiempo, pH y fuerza iónica), y que además dicha estabilidad está influenciada por la proporción entre los dos PEGs que se utilizaron durante esta tesis. Por otro lado, los nanosistemas no mostraron efecto citotóxicos bajo las condiciones estudiadas. Finalmente, no se observó un aumento en la permeabilidad de las NPAu-e al incorporar ciclodextrinas, tanto en el ensayo de modelos de membrana, ni en el ensayo de penetración celular

Multifunctionalized gold nanoparticles: Interaction with phospholipidic membranes and their effects on cell viability. Gold nanoparticles (NPAu) have been used in the treatment of different pathologies as cancer and neurodegenerative diseases, due to their physical and chemical properties, like a high surface area, permeation and retention effect (EPR), and the surface plasmon resonance (SPR), among others. Within the neurodegenerative disorders, the Alzheimer’s disease (EA) is one of the most relevant, being the β-amyloid protein toxic aggregates (ATAβ) their principal therapeutic target. For this reason, its pretends to reach to these ATAβ and locally disaggregate them through the use of NPAu and their capacity to absorb high amounts of energy and dispel it like heat, with no harm on biological tissue. In vivo biodistribution experiments in our laboratory demonstrated that NPAu functionalizated with CLPFFD peptide, that recognized ATAβ, reach the brain in a very low proportion compared to the injected dose (0,05% approximately), because they stay retained in liver and spleen for their interaction with endothelial reticular system cells. For this reason, its essential increase the NPAu’s biodisponibility to enhance their brain delivery. For this purpose, spherical gold nanoparticles (NPAu-e) were multifunctionalized with polyethilenglycol (PEG) and amino-cyclodextrins (CD-NH2) to obtain a xix nanosystem that penetrate membrane models and do not have effects on cell viability. NPAu-e were functionalized with two types of PEGs; HS-PEG-OMe, which avoid nonspecific interactions and HS-PEG-COOH, which has a carboxylic group that allow the amino group binding of CD-NH2, using 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide/N-hydroxysuccinimide (EDC/NHS) reaction. NPAu were characterized by dynamic light scattering (DLS), Zeta potential, X-ray photoelectron microscopy (XPS) and transmission electron microscopy (TEM), showing changes in their physicochemical parameters that notice the multifunctionalization of the nanosystems. Further, the stability of the conjugates, with variable proportion of HS-PEG-OMe/HS-PEG-COOH, were evaluated in time (7 days), different pHs (3, 7, 9) and modifying ionic force (NaCl 150 nM). By fluorescamine assay, the degree of functionalization of NPAu with CD-NH2 was determined. Using in vitro permeability assay PAMPA and cellular penetration assays, with SH-SY5Y neuroblastoma line cell, it was determined if the changes in the physicochemical properties and the incorporation of CDs enhance the permeability of the conjugates through membranes. Moreover, through MTS and LDH viability assays, it was evaluated if the changes in the physicochemical properties of the nanosystems used in this thesis had cytotoxic effects on SH-SY5Y cell lines. xx Results obtained show that the nanosystem was stable under the studied conditions (time, pH, ionic force), and this stability is influenced by PEGs proportion used. On the other hand, the nanosystems did not show cytotoxic effects under the studied conditions. Finally, it was not observed an enhancement in the NPAu-e permeability in the membrane model and cellular penetration assays, when the cyclodextrin was incorporated