Rol de RCAN1 en la mitofagia mediada por la vía PINK1/Parkin en células madre pluripotenciales inducidas con trisomía de síndrome de Down

Abstract

El síndrome de Down (SD) es un trastorno genético que causa deficiencia intelectual y entre otros trastornos asociados, mayor incidencia a desarrollar cardiopatías. Una de las proteínas involucradas en este trastorno es RCAN1. Esta proteína pertenece a la familia de las calcipresinas, muy conservada entre especies, que regulan la morfología de las mitocondrias (los principales productores de ATP en la célula) por inhibición de la fisión mitocondrial. La fisión es un proceso celular que genera mitocondrias más pequeñas, separándolas de la red mitocondrial previo a su degradación. El proceso de degradación de mitocondrias se llama mitofagia y solo se activa en mitocondrias que presentan un bajo potencial de membrana mitocondrial (Δψm) y mayor generación de especies reactivas de oxígeno (ROS). Una de las vías mitofágicas en las células es la vía regulada por PINK1/Parkin. Esta vía sólo se activa en mitocondrias que presenta altos niveles de PINK1 por una disminución del Δψm. En este trabajo se analizó si el aumento de RCAN1, observado en el SD, inhibe la activación de la mitofagia regulada por la vía PINK1/Parkin. Se utilizó un modelo de células madre pluripotenciales inducidas (iPSC) de pacientes sanos (iPSC 2s) y pacientes con SD (iPSC 3s). Se evaluó si existían diferencias en la mitofagia regulada por PINK1/Parkin entre las iPSC 2s y las iPSC 3s. Luego se silenció RCAN1 para determinar si la disminución de sus niveles afecta la actividad mitofágica en las iPSC 3s. Finalmente, se utilizó un adenovirus para ver si el aumento en los niveles de RCAN1 altera los niveles de mitofagia basales en las iPSC 2s. Se evaluaron los efectos de las isoformas RCAN1.1 y RCAN1.4 sobre el potencial de membrana mitocondrial (Δψm), la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS), y la activación de la vía PINK1/Parkin. Se analizaron las muestras utilizando las técnicas de citometría de flujo, inmunofluorescencia y Western-Blot. Además, se estandarizó un proceso de diferenciación de ambas líneas celulares de iPSC hacia cardiomiocitos. Las iPSC 3s mostraron un mayor Δψm, mayor generación de ROS y menor activación de la vía PINK1/Parkin que las iPSC 2s, dando signos de acumulación de mitocondrias deficientes. La disminución de los niveles de RCAN1.1 disminuyó el Δψm, la generación de ROS, y aumentó la activación de la vía PINK1/Parkin en las iPSC 3s. La disminución de los niveles de RCAN1.4 no tuvo efectos en ninguno de estos parámetros en las iPSC. El aumento en los niveles de RCAN1.1 disminuyó la acumulación de PINK1 en las iPSC 2s. La diferenciación de ambas líneas hacia cardiomiocitos arrojó diferencias en las iPSC 3s, que mostraron latidos tardíos respecto a las iPSC 2s. Concluimos que la activación de la mitofagia regulada por la vía PINK1/Parkin es regulada por RCAN1.1 en las iPSC, y un aumento en sus niveles disminuye la activación de la vía como se observa en las muestras de pacientes con SD

Down syndrome is a genetic disorder that causes intellectual deficiency and among other associated disorders, greater incidence to develop cardiac diseases. One of the proteins associated in this disorder is RCAN1. This protein belongs to the calcipressin family, very conserved among species, that regulates mitochondrial morphology (the principal ATP producers in the cell) by inhibition of mitochondrial fission. Fission is a cellular process that generates smaller mitochondria, isolating them from the mitochondrial network before their degradation. The mitochondrial degradation process is called mitophagy and is only activated in mitochondria with low mitochondrial membrane potential and higher generation of reactive oxygen species. One of the pathways that regulates cellular mitophagy is the PINK1/Parkin pathway. This pathway is only activated in mitochondria with higher levels of PINK1 due to a decrease in their Δψm. In this work we analyzed if an increase in RCAN1, observed during Down Syndrome, inhibits the activation of PINK1/Parkin mitophagy. We used a model of induced pluripotent stem cells from healthy patients (iPSC 2s) and Down Syndrome patients (iPSC 3s). We evaluated if there were differences in PINK1/Parkin mitophagy between iPSC 2s and iPSC 3s. Then we silenced RCAN1 to determine if a decrease on its levels affects mitophagic activity on iPSC 3s. Finally, we used an adenovirus to see if an increase in RCAN1 levels altered basal mitophagy levels on iPSC 2s. We evaluated the effects of isoforms RCAN1.1 and RCAN1.4 over the mitochondrial membrane potential, generation of reactive oxygen species and the activation of the PINK1/Parkin pathway. We analyzed the samples using the techniques of flow cytometry, immunofluorescence and Western-Blot. Besides that, we standardized a differentiation process of both induced pluripotent stem cell lines to cardiomyocytes. iPSC 3s showed a greater mitochondrial membrane potential, greater generation of reactive oxygen species and lower activation of PINK1/Parkin pathway than iPSC 2s, giving sings of deficient mitochondrial accumulation. A decrease in RCAN1.1 levels diminished mitochondrial membrane potential, generation of reactive oxygen species and increased activation of PINK1/Parkin pathway on IPSC 3s. A decrease in RCAN1.4 levels had no effects over any of these parameters on iPSC. An increase in RCAN1.1 levels diminished PINK1 accumulation on iPSC 2s. The differentiation of both cell lines to cardiomyocytes showed differences in iPSC 3s, which showed late beats regarding iPSC 2s. We conclude that RCAN1.1 levels regulate the activation of the PINK1/Parkin pathway mitophagy in the induced pluripotent stem cells, and an increase of his levels reduces the activation of the pathway as it is observed in Down Syndrome samples