Efectos de resolvinas D1 y E1 sobre la expresión de factores proinflamatorios en fibroblastos cardíacos

Abstract

Los fibroblastos cardíacos han sido descritos clásicamente como células estructurales encargadas de la mantención de la homeostasis de la matriz extracelular, dejando de lado su participación en el proceso inflamatorio en respuesta a una injuria cardíaca. Sin embargo, hoy en día se les considera células “centinela” del corazón, por su capacidad de responder adecuadamente a mediadores endógenos o exógenos y su gran contribución al inicio, mantención y resolución de la respuesta al daño cardíaco. Uno de los agentes proinflamatorios más estudiados y utilizados es el Lipopolisacárido (LPS) bacteriano, el cual es reconocido como agonista del receptor TLR4 el cual está presente en el FC, gatillando la respuesta inflamatoria y entre ella, el reclutamiento de células del sistema inmune al sitio de daño. Esta respuesta se amplifica gracias a la secreción de citoquinas y quimioquinas proinflamatorias, el incremento de la expresión de proteínas de adhesión celular y la posterior diferenciación del FC a miofibroblasto cardíaco. Esta última célula posee un perfil secretor aumentado, y da inicio a la formación de la cicatriz del tejido. La finalización de la respuesta inflamatoria es un proceso dinámico, y está determinado por la presencia de mediadores prorresolutivos en el sitio de daño. Dentro de estos mediadores, se encuentran las Resolvinas, las cuales poseen un marcado perfil antiinflamatorio, disminuyendo la secreción de citoquinas y quimioquinas proinflamatorias, el reclutamiento de células del sistema inmune y aumentando la fagocitosis de restos celulares por parte de macrófagos. Hasta la fecha, no hay estudios sobre los efectos de estos mediadores en FC expuestos a condiciones inflamatorias. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de las Resolvinas D1 y E1 sobre la expresión de proteínas de adhesión celular ICAM-1 y VCAM-1, así como la secreción de citoquinas y quimioquinas como TNF-α, IL-6, MCP-1 e IL-10, y la expresión de pro-IL-1β en FC expuestos a un agente proinflamatorio como LPS. Para esto, los FC fueron pretratados con RvD1 o RvE1 y posteriormente estimulados con LPS durante 24 horas, luego, se recuperó el lisado celular, y se determinó la expresión de las proteínas de adhesión ICAM-1 y VCAM-1 mediante Western Blot. Por otra parte, para la determinación de citoquinas y quimioquinas, se procedió de la forma anteriormente descrita, y se recolectó el medio de cultivo, el cual fue utilizado para la medición del perfil de citoquinas y quimioquinas secretadas por el FC mediante LUMINEX. Finalmente, para determinar pro-IL-1β, los FC fueron pretratados con RvD1 o RvE1 y luego estimulados con LPS durante 8 horas, transcurrido el tiempo, se recuperó el lisado celular y se determinó la expresión de esta proteína mediante Western Blot. Se demostró que la Resolvina D1 y E1 disminuyeron el aumento de ICAM-1 y VCAM-1 inducido por LPS en FC. Adicionalmente solo la Resolvina D1 disminuyó significativamente la secreción de citoquinas y quimioquinas proinflamatorias tras dicho estímulo. Estos resultados demuestran los potentes efectos antiinflamatorios de la Resolvina D1 y promueven una prometedora herramienta farmacológica en patologías cardiovasculares

Cardiac fibroblasts (CF) have been classically described as structural cells - responsible for the maintenance of homeostasis of the extracellular matrix - leaving aside their role in the inflammatory process in cardiac injury. Nowadays, CF are considered "sentinel cells" of the heart, due to their ability to respond to endogenous and exogenous mediators and their contribution to the initiation, maintenance, and resolution of the cardiac damage response. The bacterial lipopolysaccharide (LPS) is one of the most studied proinflammatory agents, which is recognized by the Toll-like receptor 4 (TLR4). TLR4 is present in CF and its activation triggers the inflammatory response with the recruitment of immune system cells to the damage site. Then, the answer is enhanced by secretion of proinflammatory cytokines and chemokines with up-regulation of cell adhesion proteins, and CF differentiation into cardiac myofibroblast, who promote the tissue scar formation due to their enhanced secretory and migratory profile. The end of the inflammatory response is a dynamic process with the presence in injury's site of specialized pro-resolving lipid mediators (SPM). The Resolvins - a SPM Family - have an anti-inflammatory effect featured by the decrease on proinflammatory cytokines and chemokines secretion, recruitment of immune cells, and phagocytosis of cellular debris. Currently, there are no studies about the effects of these mediators on CF upon inflammatory conditions. The objective was to evaluate the effect of Resolvins D1 and E1 on the expression of cell adhesion proteins (ICAM-1 and VCAM-1) as well as the secretion profile of cytokines and chemokines (TNF-α, IL-6, MCP-1, and IL-10) induced by LPS in CF. For this, CF were pretreated with RvD1 or RvE1 and subsequently, stimulated with LPS for 24 hours, then, the cell lysate was recovered, and the expression of adhesion proteins ICAM-1 and VCAM-1 was determined by Western Blot. On the other hand, for the determination of cytokines and chemokines, the procedure was the same as described above, then, culture medium was recollected, which was used to measure the secretion profile of cytokines and chemokines by FC using LUMINEX. Finally, to determine pro-IL-1β, CF were pretreated with RvD1 or RvE1 and then stimulated with LPS for 8 hours then, the cell lysate was recovered and the expression of this protein was determined by Western Blot. It was demonstrated that Resolvin D1 and E1 decrease the LPS-induced up-regulation of ICAM-1 and VCAM-1 in CF, additionally only Resolvin D1 was able to reduce LPS-induced secretion of proinflammatory cytokines and chemokines. These results demonstrate the potent anti-inflammatory effects of Resolvin D1 and promote a promising pharmacological tool in cardiovascular diseases