Resolvina-D1 a través del receptor ALX/FPR2 aumenta la síntesis de colágeno en miofibroblastos cardiacos de rata adulta

Abstract

Introducción: Las enfermedades cardiovasculares se encuentran directamente relacionadas con un proceso inflamatorio, por lo que entender el proceso de inflamación es esencial para entender dichas enfermedades. En este proceso se encuentran varios agentes, tales como citoquinas, quimioquinas y agentes proresolutivos, los cuales mantienen en regulación dicho proceso, siendo estos últimos quienes limitan mayoritariamente su acción. A nivel cardiaco se ha descrito a los fibroblastos cardiacos (FC) como células que participan de manera activa en todo este proceso, siendo capaces de secretar diversas citoquinas, y de responder a distintos estímulos, tanto proinflamatorios como proresolutivos, además de ser tener la capacidad de diferenciarse a miofibroblastos cardiacos (MFC) La diferenciación de FC a MFC está mediada principalmente por TGF-β1, el cual se libera ya sea desde células inmunes, por efecto de angiotensina II (ANG II) sobre los mismos FC, o en condiciones in vitro por estrés mecánico. Una de las principales diferencias entre el FC y el MFC es que el MFC secreta una mayor cantidad de proteínas de matriz (principalmente colágeno), que el FC, con la finalidad de reparar el tejido cardiaco después de un daño celular. Además, en este proceso de diferenciación FC a MFC se ha demostrado un aumento en la expresión de los receptores B1 de cininas, β2-Adrenérgico, AT1 de ANG II, etc. Sin embargo, se desconoce qué ocurre con ALX/FPR2 que es el receptor de Resolvina D1 (RvD1). La RvD1 es un mediador lipídico antiinflamatorio y se ha demostrado en otros tipos celulares, que la activación de ALX/FPR2 por su ligando puede modificar los niveles de expresión de proteínas de matriz tales como α-SMA o colágeno; sin embargo, a nivel de FC y MFC no existe evidencia aún. Objetivo: Determinar que en la diferenciación de FC a MFC de rata adulta existe un aumento en la expresión de ALX/FPR2 y consecuentemente tras su activación por RvD1 se induce un aumento en los niveles de colágeno I. Materiales y Métodos: Cultivo secundario de FC adultos de rata en medio libre de suero por 24 horas fueron estimulados con RvD1 100nM en SFB 1% a distintos tiempos. Por otro lado, también se estimularon con TGF-β1 (10 ng/mL) por 72 Horas en SFB 1% con tal de diferenciarlos a MFC. Además, para el trabajo en MFC se eliminó el TGF-β1 tras cambio de medio, se esperó dos horas y se estimuló con RvD1 a distintos tiempos, en presencia y ausencia de inhibidores de vías transduccionales ERK1/2 y PI3K/AKT, así como con el antagonista del receptor ALX/FPR2. Se midieron proteínas ALX/FPR2, α-SMA, p-ERK1/2, p-AKT y colágeno I mediante Western Blot. Resultados: Tras la diferenciación de FC a MFC de rata adulta, se encontró un aumento en los niveles de expresión del receptor ALX/FPR2. En MFC, la RvD1 activó las vías de señalización ERK1/2 y PI3K/AKT y aumentó la expresión de colágeno I. Además, el aumento de colágeno causado por RvD1 se vio disminuido en la presencia de los inhibidores de las vías de señalización mencionadas y así como con el antagonista del receptor ALX/FPR2. Por otro lado, RvD1 no disminuyó los niveles de expresión de α-SMA, lo que sugiere que no revierte el proceso de diferenciación de MFC a FC Conclusión: Nuestros resultados sugieren que la diferenciación de FC a MFC de rata adulta inducida por TGF-β1 aumenta los niveles de expresión de ALX/FPR2. Lo que permite que RvD1 aumente los niveles de expresión de colágeno a través de la activación de su receptor y las vías ERK1/2 y PI3K/AKT

Background: Cardiovascular diseases are directly related to an inflammatory process, so understand the inflammation process is essential to understand the diseases. In this process there are several agents, such as cytokines, chemokines and proresolutive agents, which maintain the regulation of this process, the latter being the ones who mostly limit their action. At the cardiac level, cardiac fibroblasts (CF) have been described as cells that actively participate in this whole process, being able to secrete various cytokines, and respond to different stimuli, both proinflammatory and proresolutive, in addition to being able to differentiate to cardiac myofibroblasts (CFM) Cardiac fibroblast CF-to-CMF differentiation is mainly mediated by TGF-β1 released from immune cells by angiotensin II (ANG II) effect, or in vitro conditions due to mechanical stress. CMF can produce extracellular matrix proteins, mostly collagen, in the scar formation process. Also, in the CF-to-CMF process it has been demonstrated the upregulation of Kinin-B1 and AT1R receptor, among others. However, the presence of Resolvin D1 (RvD1) receptor, ALX/FPR2, has not been elucidated. RvD1 is an anti-inflammatory lipidic mediator that regulates matrix proteins like α-SMA and collagen in various cell types, yet there is no evidence of this effect on CMF. Purpose: To demonstrate that the CF-to-CMF of adult rat differentiation increases ALX/FPR2 protein levels, and consequently, ALX/FPR2 activation by RvD1 enhances collagen-1 synthesis. Methods: Secondary culture of adult rat CF was starved for 24 hours, stimulated with RvD1 100nM in FBS 1% at different times. On the other hand, also stimulated with TGF-β1 (10 ng/mL) for 72 hours on foetal bovine serum (FBS) 1% to induce CMF differentiation and then treated with RvD1 at different intervals in presence and absence of PD98059, LY294002 (ERK1/2 and PI3K/AKT inhibitors) and WRW4 (ALX/FPR2 antagonist). The proteins levels of ALX/FPR2, α-SMA, p-EKR ½, p-AKT and collagen-1 were measured by western blot