Nanopartículas plasmónicas para la detección de agregados del péptido β-amiloide mediante fluorescencia aumentada por superficie

Abstract

Una de las hipótesis más aceptada para la etiología de la enfermedad de Alzheimer (EA) es la “hipótesis de la cascada amiloide”. Esta hipótesis se centra en la acumulación de agregados tóxicos del péptido β-amiloide (Aβ), los que son producidos por la acción proteolítica de las enzimas β-secretasa y g-secretasa sobre la proteína precursora amiloide (APP). Los agregados de Aβ se depositan principalmente en regiones del cerebro relacionadas con la memoria. La acumulación del péptido Aβ produce un desbalance en la homeostasis neuronal que provoca su muerte, lo que posteriormente se manifestará como un deterioro cognitivo. El péptido Aβ es uno de los principales biomarcadores utilizados tanto para diagnóstico como para el seguimiento de la patología de EA. Sin embargo, su detección sólo es posible cuando ya existe un gran daño a nivel del sistema nervioso central y por tanto ya se manifiesta el deterioro cognitivo. Es así que un diagnóstico certero solo se realiza mediante examinación post-mortem (Gold Standard). En este contexto, la presente tesis apunta a desarrollar una metodología que en el futuro permitirá el diagnóstico temprano de la enfermedad. El desarrollo de diversas sondas fluorescentes que se unen a Aβ como el CRANAD y que emiten en la región del infrarrojo, muestran un potencial interesante para aplicaciones biomédicas como posibles herramientas de diagnóstico para la EA. No obstante, dichas sondas poseen un rendimiento cuántico de fluorescencia bajo, por lo que es importante aumentar la eficiencia de emisión de su fluorescencia. Por otro lado, una de las áreas de la ciencia que nos ofrece una posible solución a esta problemática es la nanotecnología, principalmente debido a la gran versatilidad de las características fisicoquímicas de los nanomateriales. Una de estas características es la Resonancia del Plasmón Superficial de las nanopartículas de oro que permite aumentar la señal fluorescente emitida por un fluoróforo lo que se conoce como Fluorescencia Amplificada por Superficie. En este trabajo se propuso la utilización conjunta de las sondas CRANAD-2 y CRANAD- 58 y de nanopartículas para la detección selectiva de diferentes agregados de Aβ (insolubles y solubles, respectivamente) in vivo. Para esto se utilizaron dos cepas transgénicas del modelo de C. elegans (Cl2006 y CL2120), que expresan Aβ(1-42) humano en células musculares, donde cada una de ellas producen diferentes agregados de Aβ (solubles e insolubles respectivamente). Nuestros resultados muestran que la administración conjunta de CRANAD y nanopartículas genera un aumento de la señal fluorescente del orden de 2,8 para CRANAD-2 y de 1,9 para CRANAD-58. También se observó un aumento en el número de agregados de Aβ detectados, indicando que la técnica utilizada fue más sensible, con respecto al empleo del fluoróforo en ausencia de las nanopartículas

One of the most accepted hypotheses for the etiology of Alzheimer's disease (AD) is the "amyloid cascade hypothesis", which focuses on the accumulation of toxic aggregates of the β-amyloid peptide (Aβ). This peptide is produced by the proteolytic action of the β- secretase and g-secretase enzymes on the amyloid precursor protein (APP). Mainly, Aβ aggregates are deposited in regions of the brain related to memory. The accumulation of the Aβ peptide produces an imbalance in neuronal homeostasis that causes death, which will subsequently manifest as cognitive impairment. The Aβ peptide is one of the main biomarkers used both for diagnosis and for monitoring the pathology of AD. However, its detection is only possible when there is already great damage at the level of the central nervous system and therefore cognitive impairment has already manifested. Thus, an accurate diagnosis is only made by post-mortem examination (Gold Standard). In this context, this thesis aims to develop a methodology that will allow early diagnosis of the disease. The development of various fluorescent probes that bind Aβ, such as CRANAD-2 and CRANAD-58, show an interesting potential for biomedical applications as possible diagnostic tools. These probes bind specifically to Aβ and as a consequence of this binding they emit a strong fluorescence signal in the infrared region, which makes it especially interesting for their biomedical applications. However, these probes have a low fluorescence quantum yield, so it is important to increase the emission efficiency of their fluorescence. On the other hand, one of the areas of research that offers us a possible solution to this problem is nanotechnology, because the physicochemical characteristics of nanomaterials make them very versatile. One of these characteristics is the Surface Plasmon Resonance, which through the dispersion effect, can increase the fluorescent signal emitted by a given fluorophore. This effect is known as Surface Amplified Fluorescence. In this work, the combined use of CRANAD-2 and CRANAD-58 and nanoparticle probes for the selective detection of different Ab aggregate species (insoluble and soluble, respectively) in vivo was proposed. For this, two transgenic strains of the C. elegans model were used (Cl2006 y CL2120), which express human Aβ(1-42) in muscle cells, where each one expresses different Aβ aggregates (soluble and insoluble respectively). Our results show that the co- administration of CRANAD and Nanoparticles generates an increase in the fluorescent signal of 2.8 times for CRANAD-2 and 1.9 times for CRANAD-58. An increase in the number of Ab aggregates detected was also observed, indicating that the technique used was more sensitive, with respect to the use of fluorophore in the absence of nanoparticles