Desarrollo de estrategias analíticas de microextracción de compuestos estrogénicos desde matrices líquidas para ser evaluados por cromatografía líquida con analizador de tiempo de vuelo y detector de masas (LC-TOF/MS)

Abstract

Los estrógenos son compuestos de origen natural como sintéticos que en el último tiempo han sido estudiados por ser considerados disruptores endocrinos. En humanos estos compuestos han producido enfermedades como: cáncer de mamas y próstata, desordenes del tracto reproductivo y bajo recuento de espermatozoides, entre otras, mientras que en organismos acuáticos se han detectados problemas de feminización, infertilidad, hermafrodismo e incluso la muerte. La estrona (E1), 17β-estradiol (E2) y estriol (E3) son los estrógenos más abundantes en el organismo, estos son producidos para regular funciones biológicas relacionadas con el crecimiento y ciclos reproductivos, tanto en humanos como en animales. En base a esta última función, se ha utilizado el estrógeno sintético 17α-etinilestradiol (EE2) como el principal compuesto activo de diferentes métodos anticonceptivos, también se ha reportado su uso para promover el crecimiento en animales. Los estrógenos son metabolizados en el hígado a través de 2 fases, donde es posible la formación de los metabolitos hidroxilados de E1 y E2 como 2-hidroxiestrona (2-OHE1), 4-hidroxiestrona (4-OHE1), 2-hidroxiestradiol (2-OHE2) y 4-hidroxiestradiol (4-OHE2) denominados catecol estrógenos, como también el metabolito hidroxilado 16-hidroxiestrona (16-OHE1), todos los anteriores han sido correlacionados con el desarrollo de distintos tipos de cánceres, a través de su transformación a semiquinonas y finalmente a quinonas, capaces de formar aductos con el ADN y producir mutaciones en los organismos. Determinar la presencia de este tipo de compuestos en matrices ambientales, matrices biológicas y/o alimenticias, podría ayudar a evitar la exposición ante estos compuestos, sin embargo se necesita tener las metodologías analíticas que puedan dar cuenta de esta información. El objetivo de esta investigación fue desarrollar metodologías analíticas que permitan extraer y determinar en forma sensible y selectiva las hormonas sexuales E1, E2, EE2 y E3 y sus metabolitos hidroxilados desde muestras de aguas residuales y muestras biológicas como orina y leche, utilizando cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS). Se desarrolló una metodología de derivatización con cloruro de dansilo para obtener derivados altamente ionizables compatibles con la espectrometría de masas en modo positivo. Se utilizó un analizador de tiempo de vuelo (TOF) y un analizador de triple cuadrupolo (QqQ) acoplados a espectrometría de masas, donde se obtuvieron los productos derivatizados con señales m/z correspondientes a la forma [M+H]+ para EE2, E1, E2, E3, 16-OHE1 y la forma [M+2H]2+ para 2-OHE1, 4-OHE1, 2-OHE2 y 4-OHE2. Estas últimas señales no reportadas previamente fueron más intensas, desde 4 veces más que las formas [M+H]+ para 2-OHE1, 4-OHE1, 2-OHE2 y 4-OHE2. Los 9 estrógenos fueron determinados instrumentalmente en corridas cromatográficas menores a 10 min, con coeficientes de correlación mayores a 0,994. Para la determinación de estos compuestos en muestras acuosas se utilizó la técnica de Extracción por Sorción en Disco Rotatorio (RDSE) y la Extracción en Fase Sólida (SPE). Mediante RDSE se logró desarrollar una metodología de extracción de estrógenos desde efluentes de plantas de tratamiento de aguas residuales (PTAR) utilizando la fase sorbente estireno-divinilbenceno (e-DVB), obteniendo recuperaciones entre el 79 y 118%, con desviaciones estándares relativas (RSD) menores al 16%. Los límites de detección (LD) y cuantificación (LC) del método estuvieron entre 0,001 y 0,012 μg·L-1 y entre 0,004 y 0,038 μg·L-1, respectivamente. La metodología fue aplicada sobre dos efluentes de PTARs de la Región Metropolitana de Santiago, pudiéndose cuantificar E1 en concentraciones de 0,012±0,003 μg·L-1 y 0,013±0,001 μg·L-1 en cada uno de ellos, mientras que E2 y EE2 fueron detectados en concentraciones por debajo del LC. Al utilizar SPE con C18 se obtuvieron recuperaciones en agua potable y en efluente sobre el 86% con valores de RSD entre el 3 y 16%, mientras que los límites de detección y cuantificación del método estuvieron entre 0,002 y 0,017 μg·L-1 y entre 0,006 y 0,058 μg·L-1. Se analizó una muestra de efluente de PTAR detectando y cuantificando E1 y E2 en concentraciones de 0,007±0,001 μg·L-1 y 0,041±0,010 μg·L-1, respectivamente. Para la extracción de estrógenos desde leche se utilizó la metodología QuEChERS citrato y para limpiar el extracto obtenido se utilizó SPE con el sorbente divinilbenceno-co-N-vinilpirrolidona, obteniéndose recuperaciones entre el 90 y 123% con valores de RSD menores al 18%. Los límites de detección y cuantificación de la metodología QuEChERS acoplada a SPE estuvieron entre 0,02 y 0,13 μg·L-1 y entre 0,05 y 0,53 μg·L-1, respectivamente. Se aplicó la metodología a muestras de leche obtenidas desde bovino lactante, bovino con 7 meses gestación y desde centros comerciales, lográndose determinar la presencia de E1 en una concentración de 0,094 μg·L-1 en la leche de bovino en gestación. Por otra parte, se aplicó una metodología de hidrólisis enzimática sobre muestras de leche obtenidas desde tiendas comerciales pudiéndose encontrar E1 en 3 muestras analizadas, encontrándose a una concentración bajo el límite de cuantificación en las muestras no hidrolizadas y en concentraciones entre 0,086 y 1,3 μg·L-1. En orina se utilizó RDSE para la extracción de estrógenos y en forma simultanea se utilizó una amina primaria secundaria (PSA) para reducir la cantidad de interferentes provenientes de esta matriz. La metodología de extracción fue optimizada y validada, mostrando recuperaciones entre el 72 y el 130% y RSD menores al 17%. Los límites de detección y cuantificación estuvieron entre el 0,10 y 0,13 μg·L-1 y entre 0,30 y 0,50 μg·L-1, respectivamente. La metodología fue utilizada para analizar muestras de orina de mujeres de 29, 35 y 53 años de edad, 2 mujeres embarazadas con 27 y 28 semanas de gestación, y una muestra de un hombre de 29 años, se aplicó un tratamiento enzimático con la enzima β–glucuronidasa previo a la extracción, a modo de determinar la cantidad de estrógenos totales, como también se analizaron las muestras sin tratamiento enzimático para determinar la cantidad de estrógenos libres. Se lograron detectar los 9 estrógenos estudiados entre las diferentes muestras analizadas, en concentraciones de 0,9 a los 73 μg·L-1 en su forma libre y entre 0,5 y 1542 μg·L-1en su forma conjugada, obteniéndose concentraciones totales que llegan hasta los 1615 μg·L-1 por analito. Las mayores concentraciones se encontraron en las muestras de orina de mujeres en gestación, siendo E3 el estrógeno encontrado en mayor concentración. Se pudo concluir que las metodologías desarrolladas permitieron determinar 8 estrógenos naturales y 1 sintético mediante metodologías simples y rápidas con buenos niveles de linealidad, selectividad, sensibilidad, exactitud y precisión en las tres matrices analizadas, donde la técnica RDSE fue adecuada para la extracción de estrógenos en matrices complejas de carácter principalmente polar como aguas y orina, mientras que QuEChERS resultó ser una metodología eficiente para la extracción de estrógenos desde matrices complejas de carácter mayormente apolar. La técnica RDSE mostró figuras de mérito similares a otras técnicas con amplio desarrollo como SPE, mientras que la metodología QuEChERS permitió la extracción de estrógenos desde leche a niveles comparables con otras investigaciones, permitiendo cuantificar E1 en las muestras de leche analizadas. La cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas resultó una técnica fundamental en la detección, confirmación y cuantificación de estos compuestos, debido a la capacidad de separación de compuestos con similares propiedades físico-químicas y a la determinación sensible y selectiva que fue posible en muestras de alta complejidad. Se determinó que la orina es una importante fuente de contaminación de estrógenos, ya que a través de la orina llegan estrógenos hacia aguas residuales, las que posteriormente son descargadas hacia el medio ambiente pudiendo afectar a la fauna acuática y otras especies que tienen interacción directa con estas aguas. Por otra parte, los humanos podríamos estar incorporando estrógenos a nuestros organismos a través de la leche, ya que si esta es extraída en bovinos que se encuentran sobre el 3er trimestre de gestación, los niveles hormonales podrían estar en torno a 1000 veces más altos que en un bovino en condiciones normales

The estrogens are compounds of natural and synthetic origin that have been recently studied as endocrine disruptors. In humans the estrogens have produced symptoms as: breast and prostate cancer, reproductive tract disorders and low sperm count, among others, while in aquatic organisms have been detected problems of feminization, infertility, hermaphrodism and even death. Estrone (E1), 17β-estradiol (E2) and estriol (E3) are the most abundant estrogens in the organism; they are related with the biological functions as growth and reproductive cycles, in humans and animals. In this last function, the synthetic estrogen 17α-ethinylestradiol (EE2) is used as the main active compound in contraceptive methods, although its use also has been reported to promote the growth of animals. On the other hand are the hydroxylated metabolites of E1 and E2 as 2-hydroxyestrone (2-OHE1), 4-hydroxyestrone (4-OHE1), 2-hydroxyestradiol (2-OHE2) and 4-hydroxyestradiol (4-OHE2) called catechol estrogens, as well as the hydroxylated metabolite 16α-hydroxyestrone (16-OHE1), all last compounds have been correlated with the development of different types of cancers, through their transformation to semi quinones and finally quinones, capable of forming adducts with DNA and producing mutations in the organisms. The objective of this research was to develop analytical methodologies that allow extract sex hormones E1, E2, EE2 and E3 and their hydroxylated metabolites from wastewater samples and biological samples such as urine and milk, and then determined sensitively and selectively by liquid chromatography, coupled to mass spectrometry (LC-MS). For the determination, a derivatization methodology with dansyl chloride was developed to obtain estrogen derivatives with highly ionizable amine functional groups in positive mode by using mass spectrometry for the detection. A time of flight analyzer (TOF) and a triple quadrupole analyzer (QqQ) coupled to mass spectrometry were used, the derivatized products were obtained with m/z signals corresponding to the form [M+H]+ for EE2, E1, E2, E3, 16-OHE1 and the form [M+2H]2+ for 2-OHE1, 4-OHE1, 2-OHE2 and 4-OHE2. These last signals not previously reported were more intense, from 4 times more than [M+H]+ forms for 2-OHE1, 4-OHE1, 2-OHE2 and 4-OHE2, reported previously. The estrogens were separated in chromatographic runs of 10 min, showing linearity for all analytes with correlation coefficients greater than 0.994. Different extraction techniques were used depending on the matrix studied. In aqueous samples the techniques rotating disk sorption extraction (RDSE) and solid-phase extraction (SPE) were used. Through RDSE it was possible to develop a methodology for the extraction of estrogens from wastewater using styrene-divinylbenzene (e-DVB) as a sorbent phase, obtaining recoveries between 79 and 118% with RSD values lower than 17%. The limits of detection (LOD) and quantification (LOQ) of the method were between 0.001 and 0.012 μg·L-1 and between 0.004 and 0.038 μg·L-1, respectively. The methodology was applied on two effluents from WWTP in the Región Metropolitana of Santiago, E1 was quantified in concentrations of 0.012±0.003 μg·L-1 and 0.013±0.001 μg·L-1, while E2 and EE2 were detected in concentrations of below the LOQ. When using SPE with C18, recoveries in drinking water and effluent were obtained over 86% with RSD values between 3 and 16%, while the detection and quantification limits of the method were between 0.002 and 0.017 μg·L-1 and between 0.006 and 0.058 μg·L-1. A sample of WWTP effluent was analyzed by detecting and quantifying E1 and E2 in concentrations of 0.007±0.001 μg·L-1 and 0.041±0.010 μg·L-1, respectively.For the extraction of estrogens from milk samples, the QuEChERS citrate methodology was used, and for clean up the extract, SPE was used with the divinylbenzene-co-N-vinylpyrrolidone copolymer sorbent, recoveries between 90 and 123% with RSD values lower than 18% were obtaining. The LOD and LOQ of the QuEChERS methodology coupled to SPE were between 0.02 and 0.13 μg·L-1 and between 0.05 and 0.53 μg·L-1, respectively. The methodology was applied to samples of commercial milk, lactating cow's milk and cow's milk with 7 months gestation, being able to determine the presence of E1 in a concentration of 0.094 μg·L-1 in milk of cow's in gestation. On the other hand, an enzymatic hydrolysis methodology was applied to milk samples obtained from commercial stores, and E1 could be found in 3 analyzed samples, being at a concentration below the limit of quantification in non-hydrolyzed samples and in concentrations between 0.086 and 1.3 μg·L-1. For urine samples, RDSE was used for the extraction of estrogens and simultaneously to primary secondary amine (PSA) was used to reduce the quantity of interferences from this matrix. The extraction methodology was optimized and validated, showing recoveries between 72 and 130% and RSD values less than 17%. The LOD and LOQ were between 0.10 and 0.13 μg·L-1 and between 0.30 and 0.50 μg·L-1, respectively. The methodology was used to analyze urine samples of women of 29, 35 and 53 years old, 2 pregnant women with 27 and 28 weeks of gestation, and of a man of 29 years old. Treatment with the enzyme β-glucuronidase was applied prior to extraction, in order to determine the total amount of estrogen and without enzymatic treatment to determine the free amount of estrogen. The 9 estrogens studied were detected in the different samples analyzed, in individual concentrations ranging from 0.9 to 73 μg·L-1 in the free form, between 0.5 and 1542 μg·L-1 in the conjugated form obtaining concentration until 1615 μg·L-1 in total per analyte. The highest concentrations were found in the urine samples of pregnant women, with E3 being the estrogen found in the highest concentration. It was concluded that the developed methodologies allowed to determine 8 natural and 1 synthetic estrogens by simple and fast methodologies with good levels of linearity, selectivity, sensitivity, accuracy and precision in the three matrices analyzed, where the RDSE technique was adequate for estrogen extraction in complex matrices of a mainly polar nature such as water and urine, while QuEChERS proved to be an efficient methodology for the extraction of estrogens from complex matrices of a mostly non-polar nature. The RDSE technique showed figures of merit similar to other techniques with extensive development such as SPE, while the QuEChERS methodology allowed the extraction of estrogens from milk at levels comparable to other investigations, allowing quantify E1 in the analyzed milk samples. Liquid chromatography coupled to mass spectrometry was a fundamental technique in the detection, confirmation and quantification of these compounds, due to the ability to separate compounds with similar physicochemical properties and to the sensitive and selective determination that was possible in samples of high complexity. It was determined that urine is an important source of estrogen contamination, since through the urine estrogens reach wastewater, which are subsequently discharged into the environment and can affect aquatic fauna and other species that have direct interaction with these waters On the other hand, humans could be incorporating estrogens into our organisms through milk, since if it is extracted in cattle that are in the 3rd trimester of pregnancy, hormonal levels could be around 1000 times higher than in a bovine in normal conditions