Evolución de los determinantes estructurales de la especificidad de sustratos en la familia 6-fosfogluconato deshidrogenasa

Abstract

La superfamilia β-hidroxiácido deshidrogenasas (βHADH) son enzimas oligoméricas que catalizan la oxidación dependiente de NAD o NADP de diversos β-hidroxiácidos (βHA). Cada subunidad está compuesta por un dominio N-terminal de plegamiento tipo Rossmann, que posee en el loop β2-α2 los motivos, NRX3K o D[V/L]X3[V/A] que constituyen el bolsillo de unión de la región ribosa-adenina del dinucleótido y un dominio C-terminal o helicoidal que es importante para la unión al βHA. Este dominio puede estar conformado de sólo 6 alfa hélices, como ocurre en el caso de las 3-hidroxisobutirato deshidrogenasa (3HIBADH) o por dos repeticiones del mismo patrón de seis alfa hélices, como en las 6-fosfogluconato deshidrogenasa (6PGDH), en que a cada unidad de seis alfa hélices se le ha denominado hemidominio. La gran mayoría de los miembros de la familia 6PGDH que han sido estudiados, son de carácter dimérico, poseen el motivo NRX3K, y muestran una estricta preferencia por NADP, como ocurre en el caso de la 6PGDH de Escherichia coli. Además, en el hemidominio duplicado, la última alfa hélice se desempaca de su subunidad e interactúa en el sitio activo de la subunidad adyacente, formando el bolsillo de unión a 6PG. Esta característica es particular de los representantes de la familia 6PGDH. Recientemente, apareció en el PDB la estructura de una 6PGDH putativa de Geobacter metallireducens (Gm6PGDH), sin caracterización asociada. A diferencia de las otras 6PGDHs, esta proteína posee sólo un hemidominio en el dominio C-terminal y tiene asociación tetramérica como las 3HIBADH, además posee el motivo de secuencia DLX3A en el loop β2-α2. La ausencia de densidad electrónica en regiones de loops y especialmente en el extremo C-terminal de la estructura impidió corroborar si en esta enzima había contribución intersubunitaria de residuos en el sitio activo. La aparición de esta información, modifica el estado del arte sobre la evolución de la familia 6PGDH. Este trabajo de tesis se enfocó en analizar la evolución de los determinantes de la especificidad por sustratos, en dos representantes de la familia 6PGDH: las enzimas de E. coli y la 6PGDH de Gluconobacter oxydans (Go6PGDH, de un hemidominio helicoidal). Se realizó un árbol estructural de las enzimas clasificadas según SCOP a.100.1.1, en donde se ve que Gm6PGDH, se encuentra más relacionada con el resto de las 6PGDHs. Esto implica que las 6PGDHs de hemidominio único habrían sido originadas desde otras βHADHs por adquisición de residuos que le confieren especificidad por 6PG. Luego de esto se realizó un árbol filogenético, enraizado con 3HIBADHs. La duplicación del hemidominio en las 6PGDHs es un evento más ancestral que la diversificación de enzimas con motivos variados en el loop β2-α2. Esto sugiere que todos los representantes de la familia 6PGDH tendrían elementos de estructura secundaria del dominio helicoidal contribuyendo en el sitio activo de subunidades adyacentes. Se subclonaron las enzimas Go6PGDH y Ec6PGDH y se caracterizó la preferencia por dinucleótidos, y por los βHAs, 6PG y 3 hidroxisobutirato (3HIBA). Ninguna enzima presentó actividad por 3HIBA, sin embargo estudios de inhibición por ese ligando, mostró que a concentraciones elevadas se logra inhibir hasta un 5 y 30 % de la actividad relativa de Ec6PGDH y Go6PGDH, respectivamente. Se caracterizó el comportamiento de los parámetros cinéticos para NAD y NADP en ambas enzimas, variando la concentración de 6PG. Interesantemente en todos los casos se obtuvo constantes catalíticas similares al tener el sitio activo saturado de 6PG, independiente si la enzima posee uno o dos hemidominios C-terminales. Se comparó la preferencia por dinucleótidos en ambas enzimas. Ec6PGDH resultó ser estrictamente preferente por NADP (1715 veces), consistente con la presencia del motivo NRX3K. Para Go6PGDH, que posee el motivo DRX3V, la enzima mostró preferente por NAD (16 veces). Con el propósito de evaluar la implicancia del motivo NRX3K en la preferencia por dinucleótidos de Ec6PGDH, se mutó por el motivo DVX3A. La mutante triple presentó un aumento de la KM para NADP de 400 veces y una disminución de la kcat de 300 veces. Para NAD en cambio, la kcat, con respecto a la enzima silvestre, aumentó 4 veces, sin embargo la KM, no presentó variaciones. Finalmente, se generó un modelo por homología de Go6PGDH que fue simulado mediante dinámicas moleculares en presencia de sus sustratos. Esto permitió evaluar los residuos implicados en la unión a los dinucleótidos además de determinar la contribución de la alfa hélice 6 del hemidominio C-terminal en la composición de los sitios activos de las subunidades adyacentes. El residuo D30 forma puentes de hidrógeno estables con el 2´-OH de la región ribosa-adenina del NAD. En la región difosfato del NAD el loop β1-α1, contribuye con residuos cuya cadena principal estabilizarían la unión al dinucleótido. En el caso del NADP, R31 ubicado en el motivo del loop β2-α2 y R10 del loop β1-α1, estabilizan al dinucleótido. Además, durante las dinámicas se forman interacciones estables entre los residuos R322 y H328 de la alfa hélice 6 con el 6PG y en algunos casos con NAD y NADP, ubicados en el sitio activo complementario, tal cual ocurre en Ec6PGDH, sustentando nuestra hipótesis que los determinantes de unión por 6PG en la familia 6PGDH se habrían generado previo a la duplicación del hemidominio C-terminal

The β-hydroxyacid dehydrogenase superfamily (βHADH) is constituted by oligomeric enzymes which catalyze NAD or NADP dependent oxidation of diverse β-hydroxyacids (βHA). Each subunit is composed by an N-terminal domain of Rossmann-like fold that possesses NRX3K or D[V/L]X3[V/A] motifs in the β2-α2 loop, these motifs constitute the binding pocket of the ribose-adenin region of the dinucleotide and a C-terminal or helical domain which is important for the binding of βHA. The C-terminal domain can be conformed by just 6 α-helixes, as it occurs in the case of the 3-hydroxybutirate dehydrogenase (3HIBADH), or by two repetitions of the same 6 alpha helixes pattern, as in the 6-phosphogluconate dehydrogenase (6PGDH), where each unit of 6 alpha helixes is called a hemidomain. Most members of the 6PGDH family which have been studied are of dimeric character, possess the NRX3K and demonstrate an strict preference for NADP, as it occurs in the case of the 6PGDH from Escherichia coli. In addition, in the second hemidomain, the last alpha helix interacts in the active site of the adjacent subunit, forming the 6PG binding pocket. This characteristic is particular of the representatives from the 6PGDH family. Recently, a putative structure of the 6PGDH from Geobacter metallireducens (Gm6PGDH) without associated characterization appeared in the PDB database. In contrast with other 6PGDH, this protein has only one hemidomain in its C-terminal domain and a tetrameric association, like the 3HIBADH, also it possesses the DLX3A motif in the β2-α2 loop. The absence of electronic density in the loop regions and especially in the C-terminal end of the structure prevented to corroborate if in this enzyme there was intersubunitary contribution of residues in the active site. This information modifies the state of the art regarding the evolution of the 6PGDH family This thesis focused on analyzing the evolution of the determinants of substrate specificity in two representatives of the 6PGDH family: The enzymes from E.coli and the 6PGDH from Gluconobacter oxydans (Go6PGDH, of one helical domain). An structural tree was built from the classified enzymes in accordance to SCOP a.100.1.1, in which it can be seen than Gm6PGDH is more closely related with the rest of the 6PGDHs and is grouped with other βHADHs. This implies that single domain 6PGDHs would have been originated from other βHADHs by the acquisition of residues that confer 6PG specificity. After this, a phylogenetic tree was built, rooted with 3HIBADHs. The duplication of the hemidomain present in the 6PGDHs is a more ancestral event that the enzyme diversification with different motifs in the β2-α2 loop. This suggests that all the representatives from the 6PGDH family would have secondary structure elements of the helical domain that participate in the site of adjacent subunits. The enzymes Go6PGDH y Ec6PGDH were subcloned. Their preferences for dinucleotides and for βHA, 6PG, and 3HIBA was characterized. None of the enzymes presented activity with 3HIBA, however, inhibition studies for this ligand showed that at high concentrations it achieved an inhibition up to 5 and 30% of the relative activity of Go6PGDH and Ec6PGDH respectively. The behavior of the kinetic parameters of NAD and NADP while varying 6PG concentration was characterized for both enzymes. Interestingly, similar catalytic constants where values were obtained when the active site was saturated with 6PG, independent of whether the enzyme possesses one or two C-terminal hemidomains. The preference for dinucletides in both enzymes was compared. Ec6PGDH resulted strictly prefent for NADP (1715 fold), which is consisted with the presence of the NRX3K motif. For Go6PGDH, which possesses a DRX3V motif, the enzyme showed a preference for NAD (16 fold) With the purpose of evaluating the implication of the NRX3K motif in the preference for dinucleotides of Ec6PGDH, it was replaced with DVX3A. The triple mutant presented an increase KM for NADP of 400 folds and a decrease of kcat of 300 folds. For NAD, the kcat in respect with the wild type enzyme increased 4 folds, however the KM remained unchanged. Finally, a model by homology of Go6PGDH was generated through simulation of molecular dynamics in the presence of its substrates. This permitted to evaluate the residues implicated in the binding to the dinucleotides and also to determine the contribution of the C-terminal hemidomain’s 6 alpha helix in the composition of the active sites of the adjacent subunits. The D30 residue forms stable hydrogen bonds with the 2’-OH of the ribose-adenin region from NAD. In the diphosphate region of NAD, the β1-α1 loop contributes with residues whose principal chain stabilizes the binding to the dinucleotide. In case of the NADP, R31, located in the motif of the β2-α2 loop, and R10, from the β1-α1 loop, stabilize the dinucleotide. Also, during the simulations, there are interactions formed between the residues R322 and H328 from the 6 alpha helix with the 6PG, and in some cases with NAD and NADP, located in the complementary active site, the same way it occurs in Ec6PGDH, which sustains our hypothesis that the determinants of 6PG binding in the 6PGDH family were generated before the appearance of the duplicated C-terminal domain