Estrategias de preparación de muestra para la determinación espectrofluorimétrica de quinolonas y tetraciclinas de uso veterinario

Abstract

En primera instancia, se estudió la conducta espectral de cada uno de los analitos pertenecientes a las familias involucrados en la investigación. Para seleccionar la longitud de excitación de los analitos en estudio se realizó un barrido en UV- visible con la finalidad de obtener los máximos de cada uno. Se utilizan los máximos obtenidos con anterioridad para realizar el estudio de la conducta espectral de los analitos por espectrofluorimetría. La longitud de onda de excitación para la determinación de los analitos midiendo la fase directa del sistema RDSE se seleccionó teniendo en consideración las longitudes de onda de excitación de los analitos y la señal intrínseca de cada una de las fases. Además, teniendo presente una diferencia con la banda de excitación, con mayor resolución a la banda de emisión de los analitos y mayor intensidad de fluorescencia, para favorecer sensibilidad al método. Se seleccionó la fase Oasis ®HLB, la que entregó un porcentaje de recuperación aceptable, mayor al 50%. Además de que presenta una banda definida y apta para cuantificar los analitos. Se realizaron estudios de las variables químicas e hidrodinámicas para los analitos representantes de las familias de las fluoroquinolonas y tetraciclinas, EFX y OTC, respectivamente. Estos resultados entregaron condiciones óptimas de trabajo: pH 4, tiempo de extracción de 120 min y una velocidad de rotación de 2.200 ± 20 rpm. Las variables espectrales óptimas seleccionadas fueron; longitud de onda de excitación de 380 nm y slit exc-em de 10-10 nm. En la extracción de EFX, CFX y OTC, se utilizó buffer McIlvaine–EDTA 0,3M pH 4 con el objetivo de mantener el pH de trabajo óptimo, además de contrarrestar alguna posible interferencia de parte del calcio presente en la muestra de leche. Se realizó una curva de calibración obteniendo una correlación entre las concentraciones y la intensidad de fluorescencia, además de sus parámetros analíticos que se presentan en la Tabla 8. La validación del método propuesto se realizó en muestras blanco con las variables químicas e hidrodinámicas optimizadas. Además del tratamiento a la muestra con 5 mL de ácido tricloroacético y centrifugación por 30 minutos. Se realizaron las curvas de calibración en muestra blanco fortificado con los analitos, lo que se muestra en la Tabla 9. Al comparar las curvas de calibración y parámetros analíticos con las del sistema, no existe algún corrimiento o cambio de forma de la señal analítica. Además, cabe destacar que los máximos de cuantificación se mantuvieron en los analitos atribuyéndolo a que cualquier interferencia fue eliminada. Tanto el calcio que fue tratado con EDTA del Buffer Mc Ilvaine- EDTA y caseína con el tratamiento de muestra con ácido tricloroacético y centrifugación. Se realizó la comparación con otra preparación de muestra, se utilizó el sistema de d-SPE donde la gran diferencia es no la utilización del dispositivo RDSE. Es decir, la fase queda depositada en el mismo vial pero no contenida en el dispositivo RDSE. Al comparar los resultados obtenidos de ambas preparaciones de muestra los límites obtenidos son del mismo orden no siendo alterados (Tabla 10), aunque el porcentaje de recuperación se ve favorecido en 10 % atribuido a una mayor recirculación de la muestra. Pese al aumento que existe en el porcentaje de recuperación se privilegia el dispositivo RDSE frente a la d-SPE por el manejo de la fase el que es crucial en la preparación de muestra previo a la medición instrumental. Además de que los límites obtenidos están dentro de métodos reportados [22]. Para validar el método propuesto, se evaluó la cuantificación posterior a la extracción de los analitos en muestra blanco para tres niveles de concentración conocidos en un grupo de muestras para analizar durante un día y durante días consecutivos con los respectivos blancos de acuerdo al procedimiento 2.6.3. Se evaluó el grado de dispersión mediante la desviación estándar relativa y la exactitud mediante el porcentaje de recuperación, los resultados obtenidos se resumen en la Tabla 13,14 y 15; en los cuales se encontró que el método propuesto presenta buena precisión, con una DER<5% y porcentajes de recuperación entre 98,3% y 101,1% para la cuantificación de los analitos utilizando el método RDSE directo, con las condiciones optimizadas. El método propuesto se aplicó en muestra de supermercado. Las concentraciones determinadas sobre la base de la adición estándar de los analitos en estudio se presentan en la Tabla 16. Las muestras fueron enriquecidas con el nivel medio de concentración correspondiente a 30 μgL-1. De acuerdo a las recuperaciones obtenidas y presentadas en la Tabla 16 no se encuentra presencia de analitos en el lote de leches analizadas. Por último, como una estrategia alternativa de determinación de los analitos se realizó la elución del dispositivo RDSE. Para llevar a cabo este procedimiento se optimizaron las variables involucradas, siendo óptimo el uso de 12,5 mL de metanol como solvente de elución por 15 minutos. Con las variables optimizadas se procedió a realizar las curvas de calibración para validar el protocolo y se logra determinar simultáneamente EFX y CFX en presencia de OTC derivando los espectros clásicos a segunda derivada privilegiando señal/ruido debido a que existe una diferencia mayor a 3 nm en su longitud de onda de emisión, además que oxitetraciclina no emite a la longitud de onda de excitación de 279 nm, como se muestra en las Figuras 49. Los parámetros analíticos se presentan en la tabla 17. De los resultados obtenidos, espectralmente se observó una dependencia lineal entre la intensidad de fluorescencia y la concentración de EFX y CFX, tendencia reflejada en el valor de R2 y R. Además, al comparar los valores LD y LC obtenidos (Tabla 17) con los de otros métodos reportados en literatura mediante extracción en fase sólida magnética y electroforesis capilar se encuentran entre 4 y 6 veces menores [37]. Con base a las observaciones y resultados anteriores, es posible indicar que los métodos desarrollados basados en la medición directa como en la elución del analito, son metodologías sensibles, de fácil desarrollo y simples; además con los valores obtenidos permitiría la determinación de EFX y CFX en muestras de leche

In the first instance, the spectral behavior of each of the analytes belonging to the families involved in the research was studied. To select the excitation length of the analytes under study, a UV-visible scan was carried out in order to obtain the maximums of each one. The maxima obtained previously are used to study the spectral behavior of the analytes by spectrofluorimetry The excitation wavelength for the determination of the analytes by measuring the direct phase of the RDSE system was selected taking into consideration the excitation wavelengths of the analytes and the intrinsic signal of each of the phases. In addition, keeping in mind a difference with the excitation band, with greater resolution to the emission band of the analytes and greater fluorescence intensity, to favor sensitivity to the method. The Oasis ®HLB phase was selected, which delivered an acceptable recovery percentage, greater than 50%. In addition, it presents a defined and suitable band to quantify the analytes. Studies of chemical and hydrodynamic variables were carried out for analytes representing the families of fluoroquinolones and tetracyclines, EFX and OTC, respectively. These results gave optimal working conditions: pH 4, extraction time of 120 min and a rotation speed of 2,200 ± 20 rpm. The optimal spectral variables selected were; excitation wavelength of 380 nm and exc-em slit of 10-10 nm. In the extraction of EFX, CFX and OTC, McIlvaine-EDTA 0.3M pH 4 buffer was used in order to maintain the optimum working pH, in addition to counteracting any possible interference from the calcium present in the milk sample. A calibration curve was made obtaining a correlation between the concentrations and the fluorescence intensity, in addition to its analytical parameters that are presented in Table 8. The validation of the proposed method was carried out on blank samples with the chemical and hydrodynamic variables optimized. In addition to treating the sample with 5 mL of trichloroacetic acid and centrifugation for 30 minutes. The calibration curves were performed on a blank sample fortified with the analytes, which is shown in Table 9. When comparing the calibration curves and analytical parameters with those of the system, there is no drift or change of shape of the analytical signal. In addition, it should be noted that the maximum quantification was maintained in the analytes, attributing it to the fact that any interference was eliminated. Both calcium that was treated with EDTA from the Mc Ilvaine-EDTA Buffer and casein with the sample treatment with trichloroacetic acid and centrifugation. The comparison was made with another sample preparation, the d-SPE system was used where the great difference is not the use of the RDSE device. That is, the phase remains deposited in the same vial but not contained in the RDSE device. When comparing the results obtained from both sample preparations, the limits obtained are of the same order and are not altered (Table 10), although the recovery percentage is favored by 10% attributed to a greater recirculation of the sample. Despite the increase in the recovery percentage, the RDSE device is favored over the d-SPE for the management of the phase, which is crucial in the preparation of the sample prior to the instrumental measurement. In addition, the limits obtained are within reported methods [22]. To validate the proposed method, the post-extraction quantification of the analytes in a blank sample was evaluated for three known concentration levels in a group of samples to be analyzed for one day and for consecutive days with the respective blanks according to procedure 2.6. 3. The degree of dispersion was evaluated by the relative standard deviation and the accuracy by the recovery percentage, the results obtained are summarized in Table 13, 14 and 15; in which it was found that the proposed method presents good precision, with a DER <5% and recovery percentages between 98.3% and 101.1% for the quantification of analytes using the direct RDSE method, with optimized conditions. The proposed method was applied to a supermarket sample. The concentrations determined on the basis of the standard addition of the analytes under study are presented in Table 16. The samples were spiked with the mean concentration level corresponding to 30 μgL-1. According to the recoveries obtained and presented in Table 16, no analytes are present in the batch of milk analyzed. Finally, as an alternative strategy to determine the analytes, the RDSE device elution was performed. To carry out this procedure, the variables involved were optimized, being optimal the use of 12.5 mL of methanol as elution solvent for 15 minutes. With the optimized variables, the calibration curves were carried out to validate the protocol and it was possible to simultaneously determine EFX and CFX in the presence of OTC, deriving the classic spectra to second derivative favoring signal / noise because there is a difference greater than 3 nm in its emission wavelength, in addition to the fact that oxytetracycline does not emit at the excitation wavelength of 279 nm, as shown in Figures 49. The analytical parameters are presented in table 17. From the results obtained, a linear dependence was observed spectrally between the fluorescence intensity and the concentration of EFX and CFX, a trend reflected in the value of R2 and R. In addition, when comparing the LD and LC values obtained (Table 17) with the of other methods reported in the literature using magnetic solid phase extraction and capillary electrophoresis are between 4 and 6 times lower [37]. Based on the previous observations and results, it is possible to indicate that the methods developed based on direct measurement and elution of the analyte are sensitive, easy to develop and simple methodologies; Furthermore, with the values obtained, it would allow the determination of EFX and CFX in milk samples