Determinación de cefepime e identificación de n-metilpirrolidina en matrices de biosólido y orina mediante HPLC-DAD, GC-μECD y AxION DSA-TOF-MS

Abstract

En la actualidad, existe una gran cantidad de compuestos químicos considerados contaminantes emergentes que pueden ingresar al medio ambiente, y ejercer efectos negativos sobre éste, como es el caso de los antibióticos que pueden generar un aumento de las resistencias a los antimicrobianos. Cefepime es uno de los antibióticos más utilizados en atención hospitalaria, el cual corresponde a una cefalosporina de 4ta generación y de alto espectro utilizada para el tratamiento de diversas infecciones, entre ellas las causadas por Pseudomonas aeruginosa. Cefepime, al ser excretado principalmente por la orina, entra a las plantas de tratamiento de aguas servidas de origen domiciliario y hospitalario. Es posible encontrar este compuesto en los biosólidos, subproducto del tratamiento de las aguas servidas, los cuales pueden ser utilizados como enmienda orgánica en agricultura, lo que podría generar un aumento en la resistencia antimicrobiana en la biota circundante. El objetivo de esta investigación fue desarrollar y validar una metodología analítica para la cuantificación de cefepime en matriz orina y biosólidos de la Región Metropolitana de Chile. Para la extracción del analito desde el biosólido se consideraron dos metodologías, agitación y ultrasonido. Para la cuantificación se utilizaron las técnicas de cromatografía líquida con detector de arreglo de diodos (HPLC-DAD) y cromatografía de gases con detector de microcaptura electrónica (GC-μECD). La confirmación del analito en las matrices se llevó a cabo con la técnica de analizador de tiempo de vuelo acoplado a un detector de masa con análisis de muestra directa (DSA-TOF-MS), que permite el análisis de las muestras sin previo tratamiento. Para todas las técnicas utilizadas se evaluaron parámetros de validación como sensibilidad, precisión, recuperación y límites de detección y cuantificación. Las condiciones de trabajo optimizadas para el análisis del analito en ambas matrices mediante HPLC- DAD, consideraron una columna C18 de fase reversa, fase móvil de 90% CH3COOH 0,1M/ 10% Acetonitrilo. Para el análisis por GC-μECD se utilizó una columna HP-5, con un programa cromatográfico de 2 etapas, realizando la derivatización del analito con MSTFA. Los resultados de la caracterización de los biosólidos usados en este estudio dieron cuenta que el contenido de carbono orgánico fue de un 72,9% para el de la Farfana y de un 48,3% para el de Melipilla. En relación a la metodología de extracción de cefepime desde biosólido, el ultrasonido resulta ser más eficiente con relación al tiempo de extracción necesario, obteniéndose porcentajes de recuperación cercanos al 100%, con una precisión menor a 0,75 %, expresada como la desviación estándar relativa. Para la cuantificación de cefepime, la técnica HPLC-DAD, demostró ser adecuada para ambas matrices, con una recuperación de 98,3% para orina y 96,3% para biosólido, con un tiempo de retención de 7,5 min, límites de detección y cuantificación menores a 0,13 y 0,31 μg/mL, respectivamente. Por otro lado, se logró desarrollar una metodología para cuantificar cefepime derivatizado con MSTFA en acetato de etilo por GC- μECD obteniéndose un tiempo de retención de 9,87 minutos con una recuperación de 99,53%, una precisión menor a 5,23% y límites de detección y cuantificación de 0,46 y 1,56 μg/mL, respectivamente. Finalmente se logró confirmar la presencia de cefepime utilizando DSA-TOF-MS en las muestras usadas previamente tanto en HPLC-DAD como en GC- μECD. Se identificó la razón m/z de 86, la cual pertenece al principal metabolito de cefepime, la N-metilpirrolidina. Con este estudio se logró confirmar que el antibiótico cefepime ingresa a las plantas de tratamiento de aguas servidas a través de los afluentes de origen antrópico y puede estar presente en los biosólidos

Currently, there are a large number of chemical compounds considered emerging pollutants that can enter the environment, and exert negative effects on it, as is the case of antibiotics that can generate an increase in resistance to antimicrobials. Cefepime is one of the most widely used antibiotics in hospital care, which corresponds to a 4th-generation, high-spectrum cephalosporin used for the treatment of various infections, including those caused by Pseudomonas aeruginosa. Cefepime, as it is excreted mainly in the urine, enters the wastewater treatment plants of home and hospital origin. It is possible to find this compound in biosolids, a by-product of sewage treatment, which can be used as an organic amendment in agriculture, which could generate an increase in antimicrobial resistance in the surrounding biota. The objective of this research was to develop and validate an analytical methodology for the quantification of cefepime in urine matrix and biosolids from the Metropolitan Region of Chile. For the extraction of the analyte from the biosolid, two methodologies were considered, agitation and ultrasound. Liquid chromatography with diode array detector (HPLC-DAD) and gas chromatography with electron microcapture detector (GC-μECD) were used for quantification. The confirmation of the analyte in the matrices was carried out with the time-of-flight analyzer technique coupled to a mass detector with direct sample analysis (DSA-TOF-MS), which allows the analysis of the samples without prior treatment. Validation parameters such as sensitivity, precision, recovery and detection and quantification limits were evaluated for all the techniques used. The optimized working conditions for the analysis of the analyte in both matrices by means of HPLC-DAD, considered a C18 column of reversed phase, mobile phase of 90% CH3COOH 0.1M / 10% Acetonitrile. For the analysis by GC-μECD, an HP-5 column was used, with a 2-stage chromatographic program, performing the derivatization of the analyte with MSTFA. The results of the characterization of the biosolids used in this study showed that the organic carbon content was 72.9% for La Farfana and 48.3% for Melipilla. In relation to the extraction methodology of cefepime from biosolid, ultrasound turns out to be more efficient in relation to the necessary extraction time, obtaining recovery percentages close to 100%, with a precision of less than 0.75%, expressed as the standard deviation. relative. For the quantification of cefepime, the HPLC-DAD technique proved to be adequate for both matrices, with a recovery of 98.3% for urine and 96.3% for biosolids, with a retention time of 7.5 min, limits of detection and quantification less than 0.13 and 0.31 μg / mL, respectively. On the other hand, it was possible to develop a methodology to quantify MSTFA derivatized cefepime in ethyl acetate by GC-μECD, obtaining a retention time of 9.87 minutes with a recovery of 99.53%, a precision of less than 5.23%. and detection and quantification limits of 0.46 and 1.56 μg / mL, respectively. Finally, the presence of cefepime was confirmed using DSA-TOF-MS in the samples previously used in both HPLC-DAD and GC-μECD. The m / z ratio of 86 was identified, which belongs to the main metabolite of cefepime, N-methylpyrrolidine. With this study, it was possible to confirm that the antibiotic cefepime enters sewage treatment plants through tributaries of anthropic origin and may be present in biosolids