Rol de RCAN1 en células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) y cardiomiocitos derivados de iPSCs de pacientes con Síndrome de Down

Abstract

El Síndrome de Down (SD) corresponde a una afección causada por la presencia de una trisomía del cromosoma 21 (Hsa21) que genera un fenotipo altamente complejo caracterizado por provocar trastornos neuronales, inmunitarios y defectos cardiacos. La sobreexpresión de genes del Hsa21 ha demostrado ser un claro responsable de la patogenia del SD, específicamente los de la región critica del síndrome de Down (DSCR). Muchos de estos genes están implicados en la regulación de la función mitocondrial, como consecuencia se genera en estos pacientes un notorio desbalance de las especies reactivas del oxígeno (ROS), provocando cambios metabólicos secundarios como apoptosis celular y fragmentación mitocondrial, que los hace más propensos a sufrir malformaciones cardiacas. Por otro lado, reportes previos han dado cuenta que los procesos de diferenciación neuronal se ven alterados en SD, generando patologías características de este síndrome que se vincularían con la relación inversa entre la proliferación y diferenciación celular, donde la falencia de un proceso afecta al otro. En consideración a estos antecedentes, se ha identificado a RCAN1 como un importante regulador de la función y dinámica mitocondrial, resultando relevante para los procesos relacionados al sistema cardiovascular. RCAN1 posee diversas isoformas expresadas en tejido cardiaco y se caracteriza por ser una de las principales proteínas sobreexpresadas en SD. También se sabe que RCAN1 es una proteína codificada en la DSCR, la cual tiene como función principal inhibir la actividad de la fosfatasa Calcineurina entre varias otras funciones. Actualmente, los modelos animales de SD fallan en reproducir el fenotipo de la patología cardiaca observada en humanos. Es así como ha surgido el uso de iPSC como un novedoso modelo que permite estudiar de mejor forma este síndrome debido a una variedad de ventajas que las iPSC poseen por sobre los modelos murinos. Por ende, a partir de los antecedentes expuestos, se propuso la siguiente hipótesis: La sobreexpresión de RCAN1 aumenta los marcadores de proliferación y daño al DNA en células madre pluripotenciales inducidas trisómicas (iPSCs) y disminuye los de diferenciación cardiaca en cardiomiocitos derivados de iPSCs de pacientes con SD. Para comprobar la hipótesis de este trabajo se evaluaron los siguientes objetivos: 1) Analizar el efecto de la trisomía del cromosoma 21 sobre la proliferación celular de iPSC disómicas y trisómicas y estudiar el rol de RCAN1 en este proceso. 2) Determinar el daño al DNA presente en iPSCs disómicas y trisómicas, y ver si se rescata este daño al recuperar la función normal de RCAN1 en estas células y; finalmente, 3) Evaluar y caracterizar el rol de RCAN1 en el proceso de diferenciación de cardiomiocitos derivados de iPSCs disómicas y trisómicas. Para esta tesis se logró comprobar que iPSC 3S proliferan más que iPSC 2S en condiciones controles por medio de la inmunomarcación del marcador de proliferación Ki67 y la expresión de genes indicadores de proliferación celular (Ki67, TPX2), y al usar un siRNA de RCAN1 se disminuyó la proliferación vista en iPSC 3S. Por otro lado, se logró evaluar el daño al DNA en estas células identificando una mayor acumulación en iPSC 3S por medio de la inmunomarcación de 8-Oxoguanina y la expresión de genes marcadores de daño al DNA (OGG1). El silenciamiento de RCAN1 fue capaz de rescatar este daño observado en iPSC 3S. Finalmente, se pudo evaluar la capacidad de diferenciación de iPSC 2S y 3S, donde se logró comprobar que cardiomiocitos derivados de iPSC 3S presentan alteraciones en la expresión de genes marcadores cardiacos dando cuenta de fallas en su diferenciación, lo cual fue rescatado al silenciar RCAN1. Además, en estas muestras se apreció disfuncionalidad en los cardiomiocitos, lo cual fue atribuido a la sobreexpresión de RCAN1 que está presente en SD. Este es el primer estudio que relaciona la sobreexpresión de RCAN1 en células iPSC de pacientes con SD con una mayor proliferación de estas células y una menor capacidad de diferenciación, lo cual se puede relacionar, en parte, con la alta frecuencia de malformaciones cardiacas observadas en esta condición

Down Syndrome (DS) corresponds to a condition caused by the presence of a trisomy of chromosome 21 (Hsa21) that generates a highly complex phenotype characterized by causing neuronal and immune disorders and heart defects. The overexpression of Hsa21 genes has shown to be clearly responsible for the pathogenesis of DS, specifically those of the critical region of Down syndrome (DSCR). Many of these genes are involved in the regulation of mitochondrial function, in consequence, a noticeable imbalance of reactive oxygen species (ROS) is generated in these patients, causing secondary metabolic changes such as cell apoptosis and mitochondrial fragmentation, which makes them more prone to suffer cardiac malformations. On the other hand, it has been seen that neuronal differentiation processes are altered in DS, generating characteristic pathologies of this syndrome that could be linked to the inverse relationship between proliferation and differentiation where the failure of one affects the other. In consideration of these antecedents, RCAN1 has been identified as an important regulator of mitochondrial function and dynamics, being relevant for processes related to the cardiovascular system. RCAN1 has various isoforms expressed in cardiac tissue and is characterized as one of the main proteins overexpressed in SD. It is also known that RCAN1 is a protein encoded in the DSCR, whose main function is to inhibit the activity of Calcineurin phosphatase among several other functions. Currently, animal models of SD fail to reproduce the phenotype of heart disease observed in humans. This is how the use of iPSC has emerged as a novel model that allows this syndrome to be better studied due to a variety of advantages that iPSCs have over murine models. Therefore, based on the exposed antecedents, the following hypothesis was proposed: The overexpression of RCAN1 increases the markers of proliferation and DNA damage in trisomic induced pluripotent stem cells (iPSCs) and decreases those of cardiac differentiation in cardiomyocytes derived from iPSCs of patients with DS. In order to verify the hypothesis of this work, the following objectives were evaluated: 1) To analyze the effect of the trisomy of chromosome 21 on the cell proliferation of disomic and trisomic iPSCs and to study the role of RCAN1 in this process. 2) Determine the damage to the DNA present in disomic and trisomic iPSCs, and see if this damage is rescued by recovering the normal function of RCAN1 in these cells and; finally, 3) To evaluate and characterize the role of RCAN1 in the differentiation process of cardiomyocytes derived from disomic and trisomic iPSCs. For this thesis, it was possible to verify that iPSC 3S proliferate more than iPSC 2S under control conditions using the immunostaining of the proliferation marker Ki67 and the expression of cell proliferation indicator genes (Ki67, TPX2), and by using an RCAN1 siRNA proliferation seen in iPSC 3S decreased. On the other hand, it was possible to evaluate the DNA damage in these cells by identifying a greater accumulation in iPSC 3S through the immunostaining of 8-Oxoguanine and the expression of DNA damage marker genes (H2AX and OGG1). The silencing of RCAN1 was able to rescue this damage observed in iPSC 3S. Finally, it was possible to evaluate the differentiation capacity of iPSC 2S and 3S, where it was possible to verify that cardiomyocytes derived from iPSC 3S present alterations in the expression of cardiac marker genes, accounting for failures in their differentiation, which was rescued by silencing RCAN1. In addition, these samples showed dysfunction in the cardiomyocytes, which was attributed to the overexpression of RCAN1 that is present in SD. This is the first study that relates the overexpression of RCAN1 in iPSC cells of patients with DS with a greater proliferation of these cells and a lower capacity for differentiation, which may be related, in part, to the high frequency of cardiac malformations observed in this condition