Sobreexpresión de TRPM4 y KCTD5 como biomarcadores de cáncer de mama triple negativo

Abstract

El cáncer de mama es una de las principales afecciones en mujeres chilenas, afectando a 32/100.000 mujeres y con una tasa de mortalidad de 14,5, lo que vuelve necesario la búsqueda de mejoras en la detección e identificación rápida y precisa. El cáncer de mama se puede clasificar respecto a distintos parámetros, tales como el cuadro clínico de la enfermedad o las propiedades histológicas del tumor, pero uno de los métodos con mayor utilidad por su valor pronóstico y predictivo es la tipificación por los siguientes biomarcadores proteicos; Receptor de Estrógeno, Receptor de Progesterona, el Receptor 2 de factor Epidérmico Humano y la proteína Ki-67, todos detectados por inmunohistoquímica. Su patrón de expresión permite identificar el subtipo de cáncer, pronóstico y terapia correspondiente. Uno de los problemas que comparten todas las tipificaciones de cáncer de mama es su limitada precisión; carcinomas con los mismos marcadores no responden de igual manera a la terapia, debido a que la clasificación existente no es lo suficientemente precisa. Es por esto por lo que la identificación de nuevos biomarcadores moleculares que permitan tipificar con mayor precisión los distintos carcinomas es necesaria. Dentro de las proteínas con expresión dispar entre los tejidos sanos y tumorales se encuentra la superfamilia de canales iónicos TRP (Receptores de Potencial Transitorio). La expresión de miembros de la superfamilia se ha visto alterada en distintos cánceres, tales como el colorrectal y estomacal. Uno de sus miembros es TRPM4, un canal de cationes monovalentes regulado por Ca2+, involucrado en eventos celulares relacionados a la progresión del cáncer y que presenta una expresión está alterada en distintos tipos de la enfermedad. Una de las proteínas reguladoras de TRPM4 es KCTD5, una proteína adaptadora que forma parte del complejo de ubiquitinación Cul3, actúa como regulador positivo del canal. En nuestro laboratorio hemos encontrado que KCTD5 participa en la migración y proliferación celular. Datos provenientes de bases bioinformáticas sugieren que ambos genes se sobrexpresan en pacientes con temprana mortalidad, lo que indicaría un posible valor diagnóstico de ambas proteínas en esta patología, por lo que se propone a TRPM4 y KCTD5 como posibles biomarcadores en cáncer de mama. Para evaluar esto se determinaron los niveles del mRNA de ambos genes por medio de RT-qPCR en líneas celulares modelo de cáncer de mama, posteriormente estos datos se compararon con la expresión proteica evaluada por Inmunoblot. Con el fin de correlacionar los datos obtenidos con lo observado en el modelo celular con el diagnóstico clínico de los distintos tipos de la enfermedad, se evaluaron la expresión de sus mRNA en micro arreglos de cDNA de muestras de tejidos tumorales y tejidos sanos que poseen detallado el historial clínico de los pacientes. Finalmente, se realizó inmunohistoquímica en muestras de pacientes para comparar los niveles de expresión de mRNA y proteína en los distintos tipos y estadios de la enfermedad. Se encontró que ambos genes se sobrexpresan a nivel de mRNA y proteína en diferentes subtipos de la enfermedad, especialmente en los pacientes triple negativo, que sufren una alta mortalidad en el corto plazo y carecen de tratamientos específicos. Por lo que tanto, TRPM4 como KCTD5 parecen buenos candidatos como marcadores para detección o posibles blancos terapéuticos asociados a este subtipo

Breast cancer is one of the main conditions in Chilean women, affecting 32/100,000 women and with a mortality rate of 14.5. Thus, the improvements in the detection and rapid and accurate subtype identification are one way of decreasing this numbers. Breast cancer can be classified according to different parameters, such as the clinical parameters related to the disease or the tumor histological properties. However, one of the most useful methods because of its prognostic and predictive value is the immunohistochemistry-based typification by protein biomarkers, such as Estrogen Receptor (ER), Progesterone Receptor (PgR), Receptor 2 of Human Epidermal Factor (HER2) and Ki-67 protein levels. The expression pattern of these proteins allows to identify the cancer subtype, its prognosis and corresponding therapy. One of the problems shared by all types of breast cancer typification is its limited accuracy. Carcinomas with the same markers do not respond in the same way to therapy, because the existing classification is not specific enough. Thus, the identification of new molecular biomarkers is important, since it will allow more accurate identification of breast cancer subtypes. Among the proteins with altered expression between healthy and tumor tissue, there are the TRP channels (Transient Receptor Potential) superfamily. Members of this superfamily have been reported as altered in different cancer types, such as colorectal and gastric cancer. One of these channels is TRPM4, a calcium activated non-selective monovalent cation channel involved in cellular events related to cancer progression, such as migration and proliferation. It has been reported that its expression is altered in different types of the disease. One of the proteins that regulate TRPM4 activity is KCTD5, an adaptor protein that is part of the Cul3 Ubiquitination complex, acting as a positive regulator of the channel. We have found that KCTD5 also regulates cell migration and proliferation. Data from bioinformatic databases suggest that expression of both TRPM4 and KCTD5 is altered in breast cancer at different stages, which would indicate a possible diagnostics value of these proteins. As such TRPM4 and KCTD5 are proposed as possible biomarkers in breast cancer. To evaluate this, the mRNA levels of both genes were determined by RT-qPCR in breast cancer model cell lines. Moreover, these data were compared with the protein expression determined by immunoblot. We also determined the expression levels of TRPM4 and KCTD5 by RT-qPCR from cDNA arrays of patient samples of tumor and healthy tissues. Finally, immunohistochemistry was performed in patient samples to compare the levels of messenger and protein expression in the different types and stages of the disease. We found that both mRNA and protein levels of these genes had an increased expression in breast cancer tumor subtypes, remarkably in triple negative patients, a subtype with a higher mortality rate and no specific therapy associated. The overexpression of both TRPM4 and KCTD5 in this subtype opens the possible use of these proteins as biomarkers for an early and clear detection or as therapeutics targets specific for this subtype